ساختار کلاهک یک جزء ضروری در توسعه واکسن‌های mRNA و روش‌های درمانی است. فناوری mRNA مصنوعی به Cap1 برای افزایش پایداری، کارایی ترجمه و کاهش تشخیص ایمنی ذاتی mRNA توسط گیرنده‌های شبه عوارض (TLR) و سایر حسگرهای ایمنی متکی است و فعال‌سازی ناخواسته ایمنی را به حداقل می‌رساند. این امر از پاسخ های التهابی نامطلوب جلوگیری می کند و در نتیجه پایداری و اثربخشی mRNA درمانی در سلول های انسانی را بهبود می بخشد.
کشف اولیه و ساختار Cap0
در اواسط دهه 1970، تحقیقات بر روی mRNA یوکاریوتی ساختار انتهایی 5' را کشف کرد که اکنون به عنوان Cap0 شناخته می شود، جایی که یک کلاهک N7-methylguanosine (m7G) به اولین نوکلئوتید در انتهای 5' متصل شده است. این اصلاح برای محافظت از mRNA از تخریب توسط اگزونوکلئازها، کمک به صادرات هسته‌ای، و ارتقای تشخیص ریبوزوم برای شروع ترجمه یافت شد. Cap0 اولین ساختار کلاهکی بود که متیلاسیون آن محدود به خود کلاهک گوانوزین بود. کشف این 5'-cap و عملکردهای آن پیشرفت قابل توجهی در درک کلاهک های mRNA یوکاریوتی و نقش آنها در تغییرات mRNA را نشان داد.
ظهور Cap1
ساختار Cap1، یکی از ویژگی‌های حیاتی mRNA یوکاریوتی، نقشی اساسی در پایداری mRNA، ترجمه و تشخیص ایمنی دارد. ساختار کلاهک mRNA، متشکل از N7-methylguanosine (m7G) متصل به اولین نوکلئوتید از طریق پیوند تری فسفات 5'-5'، از مطالعات اولیه روی تغییرات mRNA یوکاریوتی پس از رونویسی در دهه 1970 تکامل یافته است.
ساختار mRNA های سرپوش دار با انتهای 5'. 【1】 تحقیقات بیشتر نشان داد که در اکثر mRNA های یوکاریوتی، اولین نوکلئوتید پس از کلاهک (موقعیت 1+) نیز در موقعیت 2'-O ریبوز متیله می شود، فرآیندی که به عنوان متیلاسیون 2'-O شناخته می شود. این کشف که به ساختار Cap1 (m7GpppNm) معروف است، لایه دیگری از اهمیت عملکردی را به تغییرات mRNA اضافه کرد. تغییر Cap1 برای تنظیم دقیق پایداری mRNA و جلوگیری از تشخیص ایمنی توسط سیستم ایمنی ذاتی، به‌ویژه در سلول‌های پستانداران، که به فرار از شناسایی توسط گیرنده‌های تشخیص الگو مانند RIG-I، TLRs و MDA5 کمک می‌کند، یافت شد. این هم برای متابولیسم mRNA و هم برای پیشرفت فناوری‌های مبتنی بر mRNA، از جمله واکسیناسیون mRNA و کاربردهای ژن‌درمانی بسیار مهم بود.
چالش های فنی در صنعت mRNA و راه حل های فعلی
چندین چالش فنی در کاربرد گسترده و بهینه‌سازی واکسن‌های mRNA وجود دارد، از جمله مسائل مربوط به mRNA با دوز بالا، پاسخ‌های ایمنی، پایداری و تحویل. یک چالش مهم در صنعت mRNA نیاز به دوزهای بالای mRNA برای ایجاد یک پاسخ ایمنی قوی است. این به چندین عامل مربوط می شود:
تخریب سریع: mRNA ذاتاً ناپایدار و مستعد تخریب توسط آنزیم ها و ریبونوکلئازها (RNases) موجود در سیستم های بیولوژیکی است.
بازده ترجمه محدود: کارایی ترجمه mRNA به پروتئین می تواند متفاوت باشد و به مقادیر بیشتری از mRNA برای تولید سطوح آنتی ژن کافی برای پاسخ ایمنی نیاز دارد. کارایی ترجمه به میل ترکیبی Cap1 و فاکتور شروع ترجمه eIF4E مربوط می شود.
تشکیل کمپلکس اولیه شروع ترجمه در یوکاریوت ها.【3】
ایمنی زایی و واکنش های ایمنی ناخواسته: سومین مانع بزرگ، پاسخ ایمنی ذاتی است که می تواند توسط خود mRNA ایجاد شود، به ویژه برای dsRNA یا mRNA ناقص. در حالی که سطح مشخصی از فعال‌سازی ایمنی برای تحریک سیستم ایمنی تطبیقی مطلوب است، فعال‌سازی بیش از حد می‌تواند منجر به پاسخ‌های التهابی شود که ممکن است اثربخشی واکسن را کاهش دهد یا عوارض جانبی ایجاد کند.
پوشش تاریخچه فناوری
-
تکنولوژی درپوش آنزیمی: پوشش آنزیمی، که در روزهای اولیه تحقیقات mRNA معرفی شد، شامل استفاده از آنزیم‌های پوشاننده مانند گوانیلیل ترانسفراز و متیل ترانسفراز برای افزودن یک کلاهک طبیعی 5' پس از رونویسی است. این روش وفاداری و کارایی بالا را در ترجمه mRNA به ویژه برای کاربردهای درمانی تضمین می کند.
-
آنالوگ کلاه مصنوعی (دهه 1980-2000): محققان آنالوگ های کلاهک مصنوعی را برای سنتز آزمایشگاهی mRNA سرپوش دار توسعه دادند که به مطالعه عملکرد mRNA و بیان ژن کمک می کند. آنالوگ ضد کلاهک معکوس (ARCA) یک آنالوگ کلاه مصنوعی است که برای جلوگیری از ادغام نادرست کلاهک در طول سنتز mRNA طراحی شده است و کارایی ترجمه mRNA را برای واکسن ها و ژن درمانی ها بهبود می بخشد. با این حال، راندمان و بازده درپوش ARCA پایین است.
-
فناوری Cap1 (دهه 2010): TriLink's Cap1 یک روش رونویسی همزمان است که فرآیند را با استفاده از کلاهک به طور مستقیم در طول سنتز mRNA ساده می کند. این روش کارایی را افزایش می دهد و درصد بالایی از mRNA به درستی درپوش داده شده را به دست می دهد و آن را برای کاربردهای درمانی در مقیاس بزرگ مانند واکسن های mRNA ایده آل می کند.
در حال حاضر، فناوری‌های پوشش آنزیمی در توسعه درمان‌های مبتنی بر mRNA، از جمله واکسن‌های COVID-19، تضمین پایداری و ترجمه مؤثر mRNA درمانی، حیاتی بوده‌اند.
مقایسه پوشش آنزیمی، نسل بعدی LZCap Capping و نسل اول روش Capping (ARCA).
توسعه آنالوگ های کلاهک نسل بعدی
هدف ما ایجاد آنالوگ های کلاهکی با مقاومت در برابر آنزیم های decapping، میل ترکیبی بالا به eIF4E برای بهبود کارایی ترجمه و ایمنی زایی پایین بود. این پیشرفت‌ها برای افزایش اثربخشی درمان‌های مبتنی بر mRNA، از جمله درمان‌های ضد سرطان و کاربردهای ژن درمانی، حیاتی هستند.
طراحی LZCap
در طراحی LZCap، ما عمدتا بر روی ایجاد یک آنالوگ کلاه با میل ترکیبی بالا به eIF4E تمرکز کردیم. آنزیم ها شناخت نسبتاً «ویژه ای» از سوبستراها دارند. بنابراین، هنگام طراحی یک ساختار کلاهک جدید، سعی می کنیم تا حد امکان شباهت خود را با ساختارهای طبیعی/شناخته حفظ کنیم. ساختار طبیعی دارای یک ریبوز 3' OH است که می تواند اصلاح شود (مثلاً متیلاسیون). بر اساس این ملاحظات، ما انتخاب کردیم که یک کربن در موقعیت 3 برای تازگی اضافه کنیم، به دنبال آن یک NH برای تقلید از پیوند هیدروژنی OH، و سپس یک گروه استیل برای کاهش باز بودن NH و افزایش قابلیت پیوند هیدروژنی آن اضافه کنیم. فعالیت LZCap بهتر از کلاهک طبیعی متیله است، احتمالاً به دلیل افزایش پیوند هیدروژنی. در مقایسه با گروه‌های متیل و متوکسی، گروه استیل آمینو ممکن است برهمکنش‌های واندروالسی را بین سوبسترا (کلاهک) و عامل آغازگر (آنزیم) افزایش دهد.
پایداری گروه استیل آمینو
گروه آمینو استیل در حال حاضر به اندازه کافی پایدار است. این بسیار پایدارتر از موقعیت 7 متیله و پیوند فسفودی استر است که ناپایدارترین بخش های کلاهک هستند.
بازده و کارایی پوشش LZCap
با درپوش LZCap AG(3'Acm)، راندمان پوشش mRNA لوسیفراز حدود 97.59٪ است و تا 200 میکروگرم mRNA سرپوش دار را می توان با الگوی DNA 1 میکروگرم در یک واکنش رونویسی در شرایط آزمایشگاهی (IVT) استاندارد با RNA پلیمراز T7 بدست آورد. خلوص mRNA پس از رسوب ساده LiCl تا 99٪ است. این راندمان و بازده بالا، LZCap را به گزینه ای جذاب برای کاربردهای مختلف، از جمله تولید پروتئین و ژن درمانی تبدیل می کند.
ساختار کلاهک یک جزء ضروری در توسعه واکسن‌های mRNA و روش‌های درمانی است.فناوری mRNA مصنوعی به Cap1 برای افزایش پایداری، کارایی ترجمه و کاهش تشخیص ایمنی ذاتی mRNA توسط گیرنده‌های شبه عوارض (TLR) و سایر حسگرهای ایمنی متکی است و فعال‌سازی ناخواسته ایمنی را به حداقل می‌رساند. این از پاسخ‌های التهابی ناخواسته جلوگیری می‌کند و در نتیجه پایداری و اثربخشی mRNA درمانی را در سلول‌های انسانی بهبود می‌بخشد.
| محصول | سرپوش AG (3'-OMe-7mG) | LZCap AG (3'Acm) | AG (بدون سقف) |
| بازده mRNA (μg) | 164 | 173 | 200 |
تجزیه و تحلیل MS از بازده پوشش mRNA ژن لوسیفراز LZCapped با روش مبتنی بر RNAse H. راندمان پوشش حدود 97.59٪ است.
پایداری mRNA نسبت به آنزیم جداکننده چگونه است؟
mRNA هایی با LZCap AG (3'Acm) و LZCap AG M6 (3'Acm) مقاومت بیشتری نسبت به آنزیم decapping (NEB) نشان می دهند. اشاره شده است که CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) نیز در برابر آنزیم decapping مقاوم است، اما Cap AG معمولی (3'-OMe-7mG) مقاومت را نشان نمی دهد.
میل اتصال LZCap به eIF4E چگونه است؟
در مورد بیان پروتئین mRNA سرپوشیده LZCap AG (3'Acm) چطور؟
بیان mRNA ژن لوسیفراز سرپوش دار LZCap AG (3'Acm) به طور قابل توجهی بالاتر از mRNA آنالوگ Cap1 (3'-OMe-7mG) در رده های سلولی مختلف است* (3T3-L1، Hela، JAWs، HEK293T و Huh7)، بیان L30 برابر با 130 برابر نشان داد. AG (3'Acm) mRNA ژن لوسیفراز را درپوش داشت نسبت به mRNA با پوشش (3'-OMe-7mG). نتیجه مشابه در موش مشاهده شده است. سطح بیان پروتئین ممکن است با توالی های مختلف mRNA کمی متفاوت باشد.
آیا داده های حیوانی بیشتری دارید؟
راندمان بیان LZCap AG (3'Acm) یا LZCap AG (3'FMom) درپوش
mRNA ژن کد کننده GLuc بیان بیشتری را در داخل بدن نسبت به mRNA های پوشیده شده CapAG (3'-OMe-7mG) در Cynomolgus Monkey و Pig نشان می دهد.
در مورد ایمنی زایی ذاتی mRNA های دارای پوشش LZCap AG چطور؟
mRNA های درپوش دار LZCapAG (3'Acm) ایمنی ذاتی کمی را نشان می دهند. TLR8، TLR7، IL-1A و B نقش مهمی در پاسخ ایمنی ناشی از RNA بدون پوشش دارند. مطالعات in vivo تجزیه و تحلیل ایمنی زایی mRNA LZCapped نشان داد که RNA بدون کلاهک باعث تغییرات قابل توجهی در سطح رونویسی عوامل مرتبط با ایمنی در موش می شود. هر دو mRNA های دارای پوشش LZCap و 3'-OMe-7mG سطح رونویسی فاکتور ایمنی پایین تری را در موش ها پس از یک تزریق تحریک شده با RNA نشان می دهند.
تست ایمنی انجام دادی؟
بله، ما تست سمیت سلولی، مطالعه مهار پلیمراز انسانی و تست ایمز را انجام دادیم.
- سمیت سلولی برای مونومر نوکلئوزیدی 3'-Acm-7mG(CC50~10000nM) در سلول های 293T,Huh7,MRC5,THP1 و U87MG مشاهده نشده است.
- DNA پلیمراز انسانی (α، β، γ و Klenow) و مطالعات مهار فعالیت RNA پلیمراز میتوکندری (hPOLRMT) نشان می دهد که TP 3'-Acm-7mG DNA یا RNA پلیمراز انسانی را مهار نمی کند.
- آزمایش جهش معکوس باکتریایی (Ames) تغییرات ژنتیکی مرتبط و همچنین سرطان‌زاهای ژنوتوکسیک را در اکثر جوندگان و انسان‌ها شناسایی می‌کند. آزمایش ایمز نشان داد که 3'-Acm-7mG هیچ گونه سمیت ژنتیکی ندارد.
آیا این محصول ثبت اختراع شده است؟
بله. این پتنت در ایالات متحده آمریکا اعطا شده است.
اطلاعات سفارش
| نام محصول | مشخصات | شماره کاتالوگ |
| LZCap AG (3'Acm) ( 100 میلی متر) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | 10684ES |
| LZCap AU (3'Acm)( 100 میلی متر) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | 10685ES |
| LZCap GG (3'Acm) ( 100 میلی متر) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | 10686ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy5) ( 25 میلی متر) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | 10688ES |
| LZCap AG (3'Ma-Cy7)( 25 میلی متر) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 میلی‌مولار) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biotin) (25 میلی‌مولار) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | پرس و جو |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 میلی‌مولار) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | پرس و جو |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 میلی‌مولار) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | منپرس و جو |
| LZCap (AG(3'Acm) فایرفلای luc mRNA (1μg/μL) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | منپرس و جو |
| LZCap (AG(3'Acm) mRNA eGFP (1μg/μL) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | منپرس و جو |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | منپرس و جو |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1μg/μL) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | پرس و جو |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | منپرس و جو |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100 میکرولیتر، 1 میلی لیتر | منپرس و جو |
مرجع:
- مکانیسم‌های مولکولی پوشش و متیلاسیون RNA کروناویروس، Virologica Sinica 31 (1)
- واکسن‌های mRNA - عصر جدیدی در واکسن‌شناسی نات. Rev. Drug. کشف کنید. 17، 261-279 (2018).
- تنظیم شروع ترجمه توسط پروتئین اتصال RNA در پستانداران: مدولاسیون مجتمع آغاز ترجمه توسط فاکتورهای ترانس عامل، سلول ها 2021، 10 (7)، 1711