کیت سنتز RNA با بازده بالا T7 سیستم واکنش رونویسی را بهینه می کند. این کیت می تواند RNA تک رشته ای را با استفاده از RNA پلیمراز T7، DNA خطی دو رشته ای با توالی پروموتر T7 به عنوان الگو، و NTPs به عنوان بستر برای کنترل توالی DNA در پایین دست پروموتر، سنتز کند. در طول رونویسی، نوکلئوتیدهای اصلاح شده را می توان به سوبسترا اضافه کرد تا بیوتین یا RNA نشاندار شده با رنگ آماده شود.

1. معرفی کیت سنتز RNA با بازده بالا T7
2. اصول در شرایط آزمایشگاهی رونویسی
3. مزایای کیت سنتز RNA با بازده بالا Yeasen T7
4. عملکرد محصول
5. نحوه استفاده از این کیت
6. سوالات متداول
7. اطلاعات سفارش

1. معرفی کیت سنتز RNA با بازده بالا T7

کیت سنتز RNA با بازده بالا T7 می تواند رونوشت های بلند و رونوشت های کوتاه را سنتز کند و RNA را می توان 100-200 میکروگرم با 1 میکروگرم ورودی الگوی DNA تولید کرد. RNA سنتز شده را می توان برای کاربردهای مختلف پایین دستی، مانند تحقیقات ساختار و عملکرد RNA، حفاظت از RNase، هیبریداسیون پروب، تداخل RNA، ریز تزریق و در شرایط آزمایشگاهی ترجمه

2. اصول در شرایط آزمایشگاهی رونویسی

شکل 1. در شرایط آزمایشگاهی فرآیند رونویسی

3. مزایای کیت سنتز RNA با بازده بالا Yeasen T7

بازده بسیار بالا - تا 200 میکروگرم در 2 ساعت
همه کاره - مناسب برای رونوشت های RNA 20nt-10000nt
کاربردهای متعدد - RNA بدون برچسب، نشاندار یا درپوش تولید می کند

4. عملکرد محصول

شکل 2. مقایسه بازده IVT

توجه: تمام معرف های واکنش از کیت سنتز RNA T7 (شرکت Yeasen#10623 یا B*). بازده واکنش IVT شرکت Yeasen و B* در بالا نشان داده شده است.

شکل 3. کیفیت محصولات رونویسی برای طول های مختلف

شکل 4. سطح بیان mRNA رونویسی شده در سلول های HEK-293

توجه: mRNA با آنزیم پوشاننده واکسینیا پوشیده شده است (Yeasen#10614/10615)

5. نحوه استفاده از این کیت

5.1 معرف های ذوب

T7 RNA پلیمراز را برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ کرده و روی یخ قرار دهید. بافر رونویسی 10× و ریبونوکلئوتیدها (ATP، CTP، GTP، UTP) را ذوب کنید، مخلوط کنید و به انتهای لوله سانتریفیوژ کنید، 10× بافر رونویسی را در دمای اتاق قرار دهید و چهار نوع ریبونوکلئوتید را روی یخ قرار دهید.

5.2 سیستم واکنش رونویسی را مطابق جدول زیر آماده کنید

جدول 1.روش تهیه سیستم واکنش رونویسی

توجه:
الف) واکنش در دمای اتاق تهیه می شود. از آنجایی که بافر رونویسی 10 حاوی اسپرمیدین است، غلظت اسپرمیدین خیلی زیاد در دماهای پایین باعث رسوب الگوی DNA می شود.
ب) رونوشت کوتاه (<100 nt)، می توان از الگوی 2 میکروگرم استفاده کرد، زمان رونویسی به 4-8 ساعت افزایش یافت.
ج) برای رونوشت های طولانی (بیش از 1000 nt)، از الگوهای پلاسمید خطی شده برای رونویسی استفاده شود.
د) واکنش را در دستگاه PCR با درب داغ باز انجام دهید تا از تبخیر طولانی مدت محلول واکنش جلوگیری شود.
ه) محصول واکنش ممکن است دارای رسوب سفید باشد. این پیروفسفات منیزیم است که توسط پیروفسفات آزاد و یون‌های منیزیم در طول واکنش تشکیل می‌شود که بر آزمایش‌های بعدی تأثیری نخواهد داشت. برای حذف آن می توانید EDTA اضافه کنید. اگر نگران هستید که افزودن EDTA بر آزمایش‌های بعدی تأثیر بگذارد، مایع رویی نیز می‌تواند با سانتریفیوژ بازیابی شود.
و) معرف ها و ظروف باید بدون آلودگی RNase باشند.

5.3 در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت جوجه کشی کنید

محلول واکنش فوق را با هم مخلوط کرده، برای مدت کوتاهی در انتهای لوله سانتریفیوژ کرده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت انکوبه کنید. اگر طول رونوشت کمتر از 100 nt باشد، زمان واکنش را به 4-8 ساعت افزایش دهید.

5.4 درمان DNase I (اختیاری)

پس از تکمیل واکنش، 2 میکرولیتر DNase I (بدون RNase) به هر لوله اضافه کنید و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه انکوبه کنید تا DNA الگو حذف شود.

6. سوالات متداول

6.1 بازده واکنش IVT کم است

کیفیت قالب ارتباط نزدیکی با بازده دارد. اگر عملکرد گروه آزمایش به طور معنی داری کمتر از گروه کنترل مثبت باشد، دلایل احتمالی می تواند باشد.
① الگوها حاوی اجزایی هستند که واکنش IVT را مهار می کنند.
② اشکالی در قالب ها وجود دارد.

6.2 پیشنهادات

① قالب را مجدداً تمیز کنید.
② غلظت و یکپارچگی الگوها را تأیید کنید.
③ زمان واکنش را افزایش دهید.
④ ورودی قالب را افزایش دهید.
⑤ سایر RNA پلیمرازها و پروموترهای مربوطه را امتحان کنید.

6.3 بازده رونوشت های کوتاه کم است

اگر رونوشت های هدف کوتاه تر از 100 nt هستند، زمان واکنش را به 4-8 ساعت افزایش دهید یا ورودی الگوها را به 2ug در یک سیستم واکنش 20 میکرولیتری افزایش دهید.

6.4 رونوشت های طولانی تر غیرمنتظره وجود دارد

اگر نتیجه الکتروفورز ژل نشان دهد که رونوشت های طولانی تر غیر منتظره وجود دارد، دلایل احتمالی می تواند به شرح زیر باشد:
① قالب های پلاسمید ممکن است به طور کامل خطی نشده باشند.
②الگوها دارای انتهای منسجم با برآمدگی 3 اینچی هستند.
③ رونوشت ها ساختار ثانویه ای دارند که به طور کامل دناتوره نشده است.

6.5 پیشنهادات

① بررسی کنید که آیا الگوهای پلاسمید کاملاً خطی هستند یا خیر. در صورت لزوم، دوباره خطی سازی پلاسمید را انجام دهید.
②آنزیم‌های محدودکننده مناسب را برای خطی کردن قالب‌های پلاسمید انتخاب کنید و از تولید انتهای منسجم با برآمدگی‌های 3' اجتناب کنید. در صورت لزوم می توان از قطعه کلنو یا DNA پلیمراز T4 برای تولید یک انتهای صاف استفاده کرد.
③از ژل دناتوره شده برای تشخیص رونوشت استفاده کنید.

6.6 رونوشت های کوتاه تری غیرمنتظره وجود دارد

اگر نتیجه الکتروفورز ژل نشان دهد که رونوشت‌های کوتاه‌تر غیرمنتظره‌ای وجود دارد، دلایل احتمالی می‌توانند عبارتند از:
① توالی مشابه توالی پایانی RNA پلیمراز T7 در الگوها وجود دارد.
②محتوای GC قالب ها بالاست.

6.7 پیشنهادات

① دمای واکنش را کاهش دهید (مانند 30 درجه سانتیگراد) اما توجه داشته باشید که گاهی اوقات کاهش دمای واکنش باعث کاهش بازده می شود.
②دیگر RNA پلیمرازها را برای کاتالیز واکنش IVT امتحان کنید.
③اگر محتوای GC الگوها زیاد است، دمای واکنش IVT را روی 42 درجه سانتیگراد تنظیم کنید یا SSB را به سیستم واکنش IVT اضافه کنید تا بازده و طول رونوشت ها افزایش یابد.

6.8 در طول الکتروفورز ژل، رونوشت ها لکه دار می شوند

اگر در طول الکتروفورز ژل رونوشت ها لکه دار شوند، دلایل احتمالی می توانند عبارتند از:
① در طول عملیات آزمایشی آلودگی RNase وجود دارد.
②الگوهای DNA توسط RNase ها آلوده شده اند.

6.9 پیشنهادات

①اطمینان حاصل کنید که همه معرف ها با H2O بدون RNase فرموله شده اند. از نوک پیپت های بدون RNase و لوله های اپندورف استفاده کنید و در طول عملیات آزمایشی از دستکش و ماسک لاتکس یکبار مصرف استفاده کنید.
②قالب های DNA را دوباره خالص کنید.

7. اطلاعات سفارش

محصولات زیر نمایندگی ارائه شده توسط Yeasen می باشد. اندازه های اضافی موجود است. محصولات ما بسیار بهینه شده اند تا به طور هماهنگ کار کنند تا از عملکرد و تکرارپذیری برتر اطمینان حاصل شود.
ما همچنین می توانیم خدمات سفارشی ارائه دهیم. اگر به محصولی که نمایش داده نمی شود علاقه مند هستید، با ما تماس بگیرید و ما برای رفع نیازهای شما با شما همکاری خواهیم کرد.

جدول 2.اطلاعات محصول

در مورد خواندن:

معرف های درجه GMP برای سنتز mRNA در شرایط آزمایشگاهی

Yeasen Biotechnology GMP Grade mRNA ژن در شرایط آزمایشگاهی سنتز مواد خام