آشنایی با مهره های مغناطیسی پوشیده از Concanavalin A

این مقاله کاربرد Concanavalin A و جفت کووالانسی آن با مهره های مغناطیسی را شرح می دهد.

قسمت 1. کانکاناوالین A

دانه های مغناطیسی با پوشش کانکاناوالین A (مجوره های ConA)، همانطور که از نام آن پیداست، دانه های بیومغناطیسی هستند که در آنها لکتین گیاهی Concanavalin A (ConA) با نانومواد فوق پارامغناطیس جفت می شود. در ادامه به معرفی مختصری از دانه های مغناطیسی ConA می پردازیم.

Concanavalin A (ConA)، یک پروتئین لکتین گیاهی بدون ویژگی گروه خونی، اولین پروتئین لکتین گیاهی بود که از سال 1936 از لوبیا (Canavalia ensiformis، Pennisetum maritimum) جدا و خالص و متبلور شد.

ConA بسته به pH محلولی که در آن وجود دارد 2 شکل اصلی دارد: همودایمر α-2 یا هموتترامر α-4. ^[2]. تحت شرایط قلیایی (pH> 7.0) به عنوان یک تترامر (شامل چهار زیر واحد با وزن مولکولی 26 کیلو دالتون) وجود دارد. در شرایط اسیدی (pH 4.5-5.5) Con A به ساختار دایمر فعال (52 کیلو دالتون) تجزیه می شود. علاوه بر این، عملکرد ConA تحت تأثیر کاتیون های دو ظرفیتی قرار می گیرد، به عنوان مثال، در غیاب یون های فلزی (Ca)²⁺ و منگنز²⁺، ساختار و عملکرد اتصال گلیکوپروتئین آن قابل درک نیست^[¹^].

شکل (1). مدل‌سازی مولکولی (A) مونومر ConA، (B) دایمر ConA، (C) تترامر ConA با مانوز، گلوکز و یون‌های فلزی.

قسمت 2. مهره ها

دانه های بیومغناطیسی دسته ای از میکروکره های مغناطیسی با اندازه ذرات نانومتری هستند که توسط پلیمرها و نانوذرات مغناطیسی معدنی تشکیل شده اند. دانه های مغناطیسی را می توان با توجه به ساختارشان به سه دسته اصلی طبقه بندی کرد: ساختار پوسته هسته ای، ساختار نوع ساندویچی و ساختار نوع پراکنده. مواد مغناطیسی شامل پودر آهن خالص، آهن کربونیل، سنگ معدن مغناطیسی، ارتوفریت و آلیاژ کبالت آهن است. و همکاران.

نانومواد مغناطیسی به دلیل جلوه های ویژه ای که دارند مانند اثر اندازه کوچک، اثر سطحی و اثر اندازه کوانتومی و غیره در اندازه آهن هستند.₃O₄ نانوذرات کمتر از 30 نانومتر هستند، تداخل اغتشاش حرارتی داخل نانوذرات قابل توجه است و در این زمان این نانوذرات خاصیت مغناطیسی خاصی یعنی سوپرپارامغناطیس از خود نشان می‌دهند. آهن سوپرپارامغناطیس₃O₄ نانوذرات به دلیل خواص با کیفیت بالا مانند غیر سمی بودن، زیست سازگاری خوب، خواص منحصر به فرد هدف گیری مغناطیسی و سهولت تولید گرما در میدان های مغناطیسی متناوب، به طور گسترده در صنعت بیولوژیکی استفاده می شوند.

در مقابل، جفت کووالانسی ConA با میکروسفرها برای تثبیت مولکول‌های زیستی دارای مزایای زیر است:

پایداری بالا اتصال کووالانسی برای تکرارپذیری؛
اتصال لیگاند ConA بر روی سطح میکروبیدها برای برهمکنش های مولکولی هدف.
خصوصیات جنبشی محیط محلول، مناسب برای دستکاری تجربی بیولوژیکی.

قسمت 3. کاربرد دانه های مغناطیسی ConA

همانطور که در ادبیات گزارش شده است، کاربردهای اصلی دانه‌های مغناطیسی ConA به 3 سناریو طبقه‌بندی می‌شوند که انجام جداسازی غشای سیتوپلاسمی، غنی‌سازی گلیکوپروتئین و جداسازی جنبه‌های سلولی تثبیت‌شده است.

کاربرد I: جداسازی غشای سیتوپلاسمی

استفاده از دانه های مغناطیسی ConA تحت تأثیر فعال شدن کاتیون های دو ظرفیتی، به طوری که در کلسیم وجود دارد.²⁺و Mg²⁺محیط های محلول، که دارای عملکرد برهمکنش میل ترکیبی آلفا-D-مانوسیل و α-D-گلوکوزیل هستند، که در تصفیه غشای پلاسما استفاده می شود، یک راه ساده و کارآمد است. به عنوان مثال، جداسازی غشای پلاسمایی سلول ها یا بافت ها یک گام کلیدی برای به دست آوردن بیشتر پروتئین های غشای پلاسما است. ConA قادر به اتصال پروتئین های گلیکوزیله به سلول ها است و از این اصل می توان برای به دست آوردن غشای پلاسمایی با خلوص بالاتر استفاده کرد. مراحل اصلی عملیات عبارتند از: تثبیت ConA بر روی دانه های مغناطیسی با اتصال ConA بیوتینیله به دانه های مغناطیسی استرپتاویدین. انکوباسیون غشای سلولی با دانه های مغناطیسی ConA به مدت 1 ساعت. جذب روی یک قفسه مغناطیسی؛ شستشو با TBS برای 5 بار؛ و شستشوی محلول غشای سیتوپلاسمی با شوینده^[3].

شکل 2. مراحل خالص سازی دانه های مغناطیسی ConA برای غشای پلاسما

کاربرد دوم: غنی سازی گلیکوپروتئین

ConA مخصوص مانوز و گلوکز است و مانوز کونژوگه با α را که اتفاقا "الیگوساکارید هسته" بسیاری از گلیکوپروتئین های سرم و غشای سلولی است، می شناسد. بنابراین، می توان از آن در ایمونولوژی برای جداسازی مولکول های گلیکوزیله مانند گلیکوپروتئین ها در لیزات سلولی یا بافتی یا سرم استفاده کرد.

یک رویه اصلی این بود با اتصال متقابل نانو مرواریدهای مغناطیسی آمینوسیلانیزه (MNPs) با ConA از طریق یک پیوند دهنده دو عملکردی، bis-N-hydroxysuccinimide linoleate (DSS)، برای به دست آوردن دانه های مغناطیسی ConA. برای پایان دادن به اتصال غیر اختصاصی نانو مرواریدهای مغناطیسی با استفاده از متوکسی اتیلن گلیکول (MEG) و انجام جداسازی مغناطیسی. برای اضافه کردن عصاره پروتئین های غشای سلولی هضم شده با تریپسین برای انکوبه کردن دانه های مغناطیسی ConA و گلیکوپپتیدهای جذب شده و در نهایت برای شستشوی گلیکوپپتیدهای جذب شده و خشک کردن خلاء. دانه‌های مغناطیسی ConA هر دو انکوبه شدند، دانه‌های مغناطیسی ConA که گلیکوپروتئین‌های متصل داشتند توسط قفسه مغناطیسی جمع‌آوری شدند، غیر گلیکوپپتیدها شسته شدند و در نهایت گلیکوپپتیدهای گرفته شده شسته و در خلاء خشک شدند. این روش به تجزیه و تحلیل عمیق سایت های گلیکوزیلاسیون پروتئین های مرتبط با تومور (به عنوان مثال، EGFR) اجازه می دهد.^[4].

شکل 3. نانوذرات سوپرپارامغناطیس جفت شده به لکتین های مختلف

کاربرد III: جداسازی سلول های بی حرکت

استفاده از دانه‌های مغناطیسی ConA (دانه‌های مغناطیسی متصل به کووالانسی به همراه با خلوص بالا Concanavalin A) برای اتصال به گلیکوپروتئین‌های روی غشای سلولی یا غشای هسته‌ای، در نتیجه گرفتن سلول‌ها یا هسته‌ها، امکان تجسم دستکاری تجربی تعداد کمی از سلول‌ها را فراهم می‌کند. به عنوان مثال، دانه های مغناطیسی ConA در CUT&Tag و CUT&RUN استفاده می شود^[5] آزمایش‌هایی که تکنیک‌های جدیدی هستند که برای مطالعه ساختار و عملکرد کروماتین مورد استفاده قرار می‌گیرند و با اتصال دانه‌های مغناطیسی ConA به سلول‌ها برای تجسم عمل و جلوگیری از مشکل از بین رفتن سلول ناشی از سانتریفیوژ بی‌حرکت می‌شوند.

CUT&Tag و CUT&RUN در مقایسه با فناوری سنتی ChIP-seq برای مطالعه برهمکنش‌های DNA-پروتئین دارای مزایای زیر هستند:

دانه های مغناطیسی ConA به گلیکوپروتئین های غشای سلولی متصل می شوند تا عملیات را تجسم کنند و تجربه عملیات آزمایشی را افزایش دهند.
بدون نیاز به سانتریفیوژ، فقط دانه های مغناطیسی ConA جذب شده روی قفسه مغناطیسی برای تکمیل جداسازی نمونه های سلولی و محلول ها.
می توان با کمتر از 10 سلول کار کرد و نیاز به تعداد زیادی نمونه برای Chip-seq را دور زد.

شکل 4. نمودار شماتیک جریان آزمایش Chip-seq، CUT&Tag، CUT RUN

قسمت 4. دانه های مغناطیسی با روکش YEASEN Concanavalin A

دانه های مغناطیسی ConA که توسط YEASEN توسعه یافته است، پس از انتخاب دقیق مواد خام و بهینه سازی و بهبود فرآیندهای متعدد، قادر به اتصال به گلیکوپروتئین ها، گلیکولیپیدها، پلی ساکاریدها و سایر مولکول ها با اصلاح گلیکوزیلاسیون به شیوه ای سریع، کارآمد، حساس و خاص هستند. عمدتاً برای جداسازی سلول یا برای جداسازی مولکول‌های گلیکوزیله مانند گلیکوپروتئین‌ها در لیزات سلولی یا بافتی یا سرم استفاده می‌شود و به‌ویژه مستقیماً برای آزمایش‌هایی مانند CUT &RUN و CUT&Tag (فناوری نوآورانه برای آزمایش‌های ChiP-seq) استفاده می‌شود.

1.ویژگی های محصول

تولید دسته ای پایدار و تکرارپذیری بهتر نتایج؛
ذخیره سازی عملکرد پایدار
راندمان جذب سلولی 90%

2. اطلاعات محصول

گربه شماره	Cat#19810ES
اندازه	1 میلی لیتر / 5 میلی لیتر / 20 میلی لیتر
رنگ	زرد مایل به قهوه ای
غلظت مهره	10 میلی گرم در میلی لیتر
محتوای جامد	9-11 میلی گرم در میلی لیتر
اندازه مهره	1 میکرومتر
ظرفیت	10⁵ سلول / میکرولیتر دانه

3. داده های عملکرد محصول

(1)تک پراکندگی

تحت شرایط تیمار مشابه و با بزرگنمایی 10×/40×، دانه‌های ConA اساساً تک پراکنده شدند و هیچ تجمع آشکاری نسبت به رقیب مشاهده نشد.

دانه های مواد اولیه YEASEN

دانه های ConA رقیب

دانه های YEASEN ConA (گربه شماره 19810)

شکل 5. نمودار نتایج تک پراکندگی

(2) اثر سلول اتصال دهنده دانه های ConA

همان تعداد سلول به مدت یکسان با مهره ها انکوبه شدند و تعداد سلول های باقی مانده پس از کونژوگه شدن دانه های ConA به طور خودکار در زیر آنالایزر سلولی شناسایی شد و نتایج نشان داد که YEASEN دانه های ConA (Cat#19810) از محصولات رقیب بهتر عمل کردند.

سوسپانسیون سلولی

سلول های باقی مانده پس از اتصال دانه های مغناطیسی ConA رقابتی

سلول های باقی مانده پس از اتصال YEASEN دانه های مغناطیسی ConA

شکل 6.تصویر سلول های متصل به مهره مغناطیسی ConA

(3) شماره اتصال سلول و تکرارپذیری

هر دو YEASEN 10µL دانه‌های ConA (Cat#19810) و دانه‌های ConA Competitor 10µL، تعداد سلول‌های سطح E7 را که با رقیب مقایسه می‌شوند، متصل می‌کنند. جذب سلول بیش از 90٪ تحت عملیات مکرر بود.

شکل 7. نتایج تعداد سلول های اتصال مهره های ConA و نرخ جذب

(4) پایداری شتاب

در 1 میلی لیتر در لوله توزیع کنید. شرایط نگهداری عبارت بودند از: تیمار تسریع شده در دمای 4 درجه سانتیگراد، 37 درجه سانتیگراد برای 2، 4، 7، 11 و 14 روز و تیمار تخریب -20 درجه سانتیگراد به مدت 1، 3، 6 و 8 روز. نتایج نشان داد که در شرایط آزمایشی یکسان: میزان جذب سلولی محصولات ذخیره شده در دمای 4 درجه سانتیگراد، تیمار تسریع شده در دمای 37 درجه سانتیگراد و تیمار تخریب در دمای 20- درجه سانتیگراد >95٪ بود و مقدار CV سه گروه تکرار در هر شرایط تیمار در محدوده 1٪ بود که تکرارپذیری خوبی را نشان داد.

شکل 8. نتایج نرخ جذب سلولی و بایاس تکرارپذیری دانه‌های ConA تحت دما و زمان مختلف

اطلاعات سفارش را

دانه های مغناطیسی با روکش A Concanavalin

19810ES

مقاله قبلی مقاله بعدی