آداپتور NGS، بخشی ضروری از نسل بعدی کتابخانه توالی یابی، نقشی را در اتصال قطعه DNA آزمایش شده و سلول جریان (تراشه توالی) ایفا می کند. کارایی مفصل عامل مهمی در تعیین کیفیت و عملکرد کتابخانه است. بنابراین آداپتور NGS چیست؟ انواع متداول آداپتورهای NGS چیست؟ و چگونه می توان آداپتورهای NGS مناسب را برای پلتفرم های توالی خود انتخاب کرد؟

1. آداپتور NGS چیست؟

2. هنگام انتخاب شاخص NGS چه عواملی را باید در نظر بگیرید؟

3. انواع رایج شاخص ها کدامند؟

4. انواع متداول آداپتورهای NGS کدامند؟

• آداپتور UMI
• آداپتورهای کامل
• آداپتورهای ناقص
• آداپتورهای Tn5

5. چگونه آداپتورهای NGS مناسب را برای پلتفرم های توالی خود انتخاب کنیم؟

6. در مورد ریدینگ

1. آداپتور NGS چیست؟

آداپتور NGS، مجموعه ای از آداپتورها در توالی یابی، یک توالی نوکلئوتیدی کوتاه با یک توالی شناخته شده است. به هر دو انتهای قطعه اسید نوکلئیک هدف متصل می شود. در طول توالی یابی، با هیبریداسیون با توالی شناخته شده در سلول Flow شروع به توالی یابی می کند تا کتابخانه را با تراشه ترکیب کند. بنابراین ساختار آداپتور NGS چیست؟

با در نظر گرفتن پلت فرم Illumina به عنوان مثال، یک آداپتور NGS را می توان به سه بخش تقسیم کرد:

P5 و P7: توالی ترکیب شده با P5 و P7 به سلول Flow ختم می شود تا کتابخانه روی تراشه توالی یابی ثابت شود و واکنش خوشه ای از طریق Bridge-PCR تسهیل شود.

Rd1 SP و Rd2 SP (Read1/Read2 sequencing Primer): نواحی اتصال پرایمرهای توالی یابی، نشان دهنده موقعیتی است که دنباله شروع به خواندن می کند.

فهرست (همچنین به عنوان بارکد شناخته می شود): یک توالی مصنوعی شناخته شده که برای تشخیص نمونه های مختلف در توالی یابی کتابخانه مختلط استفاده می شود.

شکل 1 پلت فرم Illumina کتابخانه تک فهرست

شکل 2 کتابخانه فهرست تک پایانی پلت فرم MGI

با افزایش توان توالی یابی، می توان چندین نمونه را به طور همزمان توالی یابی کرد. بنابراین نحوه تشخیص نمونه های متنوع از اهمیت ویژه ای برخوردار است. همانطور که قبلا ذکر شد، توالی های شاخص آداپتور NGS برای تمایز نمونه های مختلف در توالی یابی نسل بعدی (NGS) استفاده می شود. هنگام انتخاب شاخص چه عواملی را باید در نظر بگیرید؟ لطفا به خواندن ادامه دهید...

2. هنگام انتخاب شاخص چه عواملی را باید در نظر بگیرید؟

این شاخص به طور کلی در طول 6nt-18nt است و بر اساس تعداد شاخص ها به یک شاخص تک و یک شاخص دوگانه تقسیم می شود. شاخص دوگانه در هر دو انتهای قطعه مورد آزمایش قرار دارد. هنگام انتخاب ترکیب شاخص باید تعادل پایه و تعادل فلورسانس در نظر گرفته شود.

تراز پایه به تعادل بین چند شاخص اشاره دارد، نه تعادل پایه در یک شاخص. باید از هر دو نوع پایه و توزیع پایه در نظر گرفته شود. اصل ترکیب این است که چهار پایه A/T/C/G در یک گروه از شاخص‌ها باید گنجانده شوند و نسبت این چهار پایه نزدیک است و به ترتیب حدود 25 درصد را شامل می‌شود.

تعادل سیگنال فلورسانس به انتخابی برای اطمینان از تعادل سیگنال های فلورسنت در زمانی که تعادل پایه تضمین نمی شود اشاره دارد. در ترتیب سنج 4 کانالی در پلتفرم Illumina، dG/dT با فلورسانس سبز و dC/dA با فلورسانس قرمز برچسب گذاری شده است. در طول توالی یابی، سیگنال های فلورسانس سبز و قرمز باید در هر چرخه وجود داشته باشد تا از توالی یابی موفق اطمینان حاصل شود. بنابراین هنگام انتخاب شاخص باید تعادل بین سیگنال سبز و سیگنال قرمز در نظر گرفته شود.

3. انواع رایج شاخص ها کدامند؟

شاخص های دوگانه متداول معمولاً شامل شاخص دوگانه منحصر به فرد (UDI)، بارکد دوگانه منحصر به فرد (UDB) و شاخص دوگانه ترکیبی (CDI) هستند که به طور قابل توجهی جهش و تخصیص نادرست شاخص را کاهش می دهند.

UDI&UDB: شاخص‌های هر دو انتها یک به یک متناظر هستند، به صورت گروهی طراحی شده‌اند و می‌توانند در هر دو انتها تأیید شوند.

کیت Stubby UDI Primer برای Illumina ارائه شده توسط Yeasen (Cat#12404ES/12405ES)>>

CDI: نمایه ها در هر دو انتها را می توان با توجه به الزامات خاصی ترکیب کرد تا یک کتابخانه فهرست دو طرفه تشکیل شود.

پرایمر 384 CDI برای Illumina,Set1-Set2 عرضه شده توسط Yeasen (Cat#12412ES/12413ES)>>

به منظور بهبود توان عملیاتی و راندمان تقویت و کاهش هزینه توالی‌یابی، Illumina فناوری خوشه‌بندی سلول جریان آرایه (PFCT) و تقویت انحصاری (ExAmp) را برای Novaseq و دیگر توالی‌سنج‌های با توان بالا معرفی کرد، اما به‌طور ناخواسته پدیده عدم تطابق برچسب نمونه و هوم شاخص را تقویت کرد.

شکل 3 مدل های مختلف ابزار Illumina از سلول جریان بدون طرح یا سلول جریان الگودار استفاده می کنند

به منظور جبران مشکل حلقه بندی شاخص که توسط پلتفرم های توالی یابی مانند HiSeq3000/4000، HiSeq X Series و NovaSeq برجسته شده است، Illumina استراتژی قرار دادن ایندکس را در هر دو انتهای کتابخانه پیشنهاد کرد که می تواند تأیید دوطرفه را انجام دهد و آداپتورهای ناهماهنگ را حذف کند. هنگام استفاده از شاخص های منحصر به فرد در هر دو انتها، نرخ تخصیص خطای شاخص به 0.01٪ کاهش می یابد. در مقایسه با روش ترکیبی گروه جایگشت شاخص متداول قبلی، جهش شاخص تا دو مرتبه قدر کاهش می یابد.

در ساخت یک کتابخانه بدون PCR، یک آداپتور شاخص تک انتهایی در دسترس است. عدم تطابق برچسب عمدتاً ناشی از خطاهای توالی است. به طور کلی، نرخ عدم تطابق برچسب پایین است (میانگین 0.0004٪، تا 0.001٪). با این حال، در ساخت یک کتابخانه ضبط هدفمند، مشکل تداخل تقویت می شود زیرا چندین مرحله منجر به عدم تطابق برچسب می شود و معمولاً از آداپتورهای UDI/UDB/CDI استفاده می شود.

4. انواع متداول آداپتورهای NGS چیست؟

با توسعه فناوری توالی، انواع بیشتری از آداپتورها مانند آداپتورهای تک شاخص / دو شاخص (همانطور که در بخش 3 ذکر شد)، آداپتورهای UMI، آداپتورهای transposase، آداپتورهای کامل/ناقص و غیره وجود دارند که برای انواع سناریوهای کاربردی مناسب هستند. این بخش به طور سیستماتیک این آداپتورها را مرتب می کند تا اساس انتخاب آداپتور را به شما ارائه دهد.

4.1 آداپتور UMI

آداپتور Unique Molecular Identifier (UMI) یک ابزار لبه برای تشخیص جهش با فرکانس پایین و تعیین کمیت مطلق است. UMI یک دنباله مصنوعی تصادفی با یک دنباله شناخته شده است. این می تواند به عنوان یک زنجیره نوکلئوتیدی کاملا تصادفی، زنجیره نوکلئوتیدی منحط جزئی یا زنجیره نوکلئوتیدی ثابت طراحی شود.طول معمولاً 10nt (UMI تک سر) یا 5-8nt (UMI دو سر) است. عملکرد آن منجمد کردن وضعیت قطعات DNA قبل از تکثیر است و هر مولکول DNA مربوط به یک UMI است. بنابراین، در طول تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک، می‌تواند الگوهای DNA را از منابع مختلف تشخیص دهد، تشخیص دهد که کدام جهش‌های مثبت کاذب ناشی از خطاهای تصادفی در فرآیند تقویت و تعیین توالی PCR هستند و در واقع توسط بیماران انجام می‌شوند، تا با فیلتر کردن نویز پس‌زمینه، تشخیص دقیق فرکانس‌های پایین و مولتی‌فرکانس‌های بسیار کم مطلق و انجام مولتیشن‌های بسیار کم مطلق و فرکانس‌های مختلف DNA انجام شود. این به طور گسترده ای در تشخیص جهش با فرکانس پایین، به ویژه در زمینه تحقیقات تومور استفاده می شود.

شکل 4 نمودار شماتیک آداپتور UMI ساختار پلت فرم ایلومینا

4.2 آداپتورهای کامل

آداپتورهای کامل، محصولی ضروری برای یک کتابخانه بدون PCR، شامل تمام توالی‌های مورد نیاز برای توالی‌یابی، مانند P5، P7، RdS1، و RdS2 در پلتفرم Illumina، همچنین توالی‌ها و توالی‌های UMI را با توجه به الزامات توالی‌یابی فهرست می‌کنند. با آداپتورهای کامل، می توان مستقیماً بدون معرفی آداپتورهای دیگر از طریق PCR توالی یابی کرد. بنابراین، آداپتورهای کامل را می توان برای ساخت یک کتابخانه بدون PCR استفاده کرد. کتابخانه های بدون PCR می توانند بایاس تقویت PCR، نرخ خطا و تکرار توالی را کاهش دهند و پوشش برخی از مناطق با GC یا AT بالا را که به طور گسترده در تحقیقات ژنوم جمعیت مورد استفاده قرار می گیرند، افزایش دهند.

یک محصول آداپتور کامل برای پلت فرم Illumina عرضه شده توسط Yeasen (Cat#13519ES/13520ES)>>

یک محصول آداپتور کامل برای پلت فرم MGI ارائه شده توسط Yeasen(Cat#13360ES/13361ES)>>

شکل 5 نمودار آداپتور کامل

4.3 آداپتورهای ناقص

آداپتورهای ناقص باید بعد از بستن آداپتور توالی های دیگری را با PCR معرفی کنند تا یک آداپتور کامل تشکیل شود. آنها با راندمان اتصال بالا و نرخ کتابخانه موثر بالا مشخص می شوند. فرآیند PCR یک اثر غنی‌سازی برای کتابخانه کامل برای اطمینان از غلظت کتابخانه مؤثر است و همچنین می‌تواند نمایه‌های دو طرفه و توالی‌های UMI را معرفی کند.

4.4 آداپتور Tn5

آداپتورهای Tn5 بخشی از توالی آداپتور را از طریق فعالیت اندونوکلئاز محدود Tn5 به هر دو انتهای قطعات DNA متصل می کنند. آنها برای صرفه جویی در زمان و نمونه ها، تکه تکه شدن و بستن آداپتور را به طور همزمان انجام می دهند. در نهایت، بقیه توالی پیوند دهنده، شاخص، UMI و توالی های دیگر توسط PCR معرفی می شوند تا یک کتابخانه کامل تشکیل شود. می توان از آن برای ساخت کتابخانه Cut&tag استفاده کرد.

شکل 6 نمودار شماتیک ساخت کتابخانه آداپتور Tn5

5. چگونه آداپتورهای NGS مناسب را برای پلتفرم های توالی خود انتخاب کنیم؟

در حال حاضر، دو پلتفرم اصلی توالی یابی وجود دارد، از جمله Illumina و MGI. Yeasen، یک راه حل کامل برای ارائه دهنده NGS، چندین آداپتور NGS مناسب برای پلتفرم های Illumina یا MGI ایجاد کرده است.

از نظر پلتفرم Illumina، آداپتورهای Illumina NGS عرضه شده توسط Yeasen شامل سه نوع، از جمله UDI، CDI و یک شاخص واحد هستند. از نظر پلت فرم MGI، آداپتورهای MGI NGS ارائه شده توسط Yeasen دارای دو نوع هستند که شامل Dual است. UMI -UDB و Single Index.اطلاعات محصول را در جدول زیر به ترتیب شامل انواع آداپتورها، اندازه های موجود و غلظت آداپتور و پرایمر آورده ایم.

آداپتورهای کامل و UDI NGS نیازی به نگرانی در مورد مشکلات کوپلینگ ندارند، مناسب برای مشتریانی که می خواهند استفاده آسان داشته باشند. آداپتورهای CDI NGS دارای لوله های کمتر و اندازه کوچک هستند که برای مشتریانی که می خواهند به راحتی ذخیره و حمل کنند مناسب است. بدون PCR نیاز به استفاده از آداپتورهای کامل NGS دارد.

برای ایلومینا

InTube	هیف NGS® دیآمادگی NA Lib 384 CDI Primer for Illumina, Set 1 (8*12, 96 index)	12412ES
	هیف NGS® دیآمادگی NA Lib 384 CDI Primer for Illumina, Set 2 (8*12, 96 index)	12413ES
	Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI Primer for Illumina, Set 1 (96 index)	12414ES
	Hieff NGS® RNA Lib Prep 384 CDI Primer for Illumina, Set 1 (96 index)	12415ES
در بشقاب	Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina (1-384 Index) ست 1-4	12407ES
	کیت پرایمر Hieff NGS® Stubby UDI برای Illumina مجموعه 1(96 چاه صفحه، 1-96 شاخص) مجموعه 1	12327ES
	کیت پرایمر Hieff NGS® Stubby UDI برای Illumina مجموعه 2(96 چاه بشقاب، 97-192 شاخص) مجموعه 2	12328ES
	کیت پرایمر Hieff NGS® Stubby UDI برای Illumina مجموعه 3(بشقاب چاه 96، فهرست 193-288) مجموعه 3	12329ES
	کیت پرایمر Hieff NGS® Stubby UDI برای Illumina مجموعه 4(صفحه چاه 96، 289-384 فهرست) مجموعه 4	12330ES

در مورد ریدینگ

آنزیم های کلیدی در ساخت کتابخانه NGS

در مورد فناوری مرتبط با NGS، چقدر می دانید؟

انواع مختلف مهره های مغناطیسی در NGS: دانه های مغناطیسی DNA\RNA\mRNA

کمی سازی کتابخانه NGS: کیوبیت سریع و دقیق یا qPCR دقیق؛ همه چیز لازم است!