انواع مختلف دانه های مغناطیسی در NGS: DNA \ RNA \ mRNA دانه های مغناطیسی

انواع مختلف مهره های مغناطیسی در NGS: دانه های مغناطیسی DNA\RNA\mRNA

مهره های مغناطیسی یکی از محصولات ضروری در ساخت کتابخانه های توالی یابی با توان عملیاتی بالا هستند. آنها می توانند DNA یا RNA را خالص کنند، قطعات DNA با اندازه هدف را غربال کنند و اسیدهای نوکلئیک هدف را غنی کنند. با توسعه فناوری توالی‌یابی، دانه‌های مغناطیسی متخصص در زمینه‌های کاربردی مختلف، از جمله دانه‌های مغناطیسی خالص‌سازی DNA، دانه‌های مغناطیسی انتخاب اندازه DNA، دانه‌های مغناطیسی خالص‌سازی RNA، و دانه‌های مغناطیسی غنی‌سازی mRNA، پدیدار شدند. بنابراین اصول مهره های مغناطیسی مختلف چیست؟ چگونه انتخاب کنیم؟

برای خرید عمده نمونه رایگان و قیمت کمتر را درخواست کنید

1. دانه های DNA
2. معرفی دانه های DNA ستاره
3. دانه های خالص سازی RNA
4. دانه های مغناطیسی غنی شده با mRNA
5. توصیه محصول دانه های مغناطیسی Yeasen

1. DNA مهره ها

1.1 اصول اساسی

اصل خالص سازی اسید نوکلئیک توسط دانه های مغناطیسی بر اساس بی حرکتی برگشت پذیر فاز جامد (SPRI) است. تحت شرایط خاص، اسید نوکلئیک به طور انتخابی به دانه های مغناطیسی متصل می شود، در حالی که آلاینده ها در محلول باقی می مانند. پس از اعمال میدان مغناطیسی، مهره های مغناطیسی متصل به مولکول های هدف از محلول جدا می شوند و سپس دانه های مغناطیسی برای حذف بیشتر آلاینده ها تمیز می شوند. از آنجا که ترکیب دانه های مغناطیسی و مولکول های اسید نوکلئیک برگشت پذیر است، اسید نوکلئیک را می توان با یک بافر کم نمک از دانه های مغناطیسی شسته شود.
سطح بیرونی دانه های مغناطیسی با گروه های عاملی هیدروکسیل یا کربوکسیل سیلیکون اصلاح شده است. در سیستم بافر خالص سازی حاوی PEG و یون های نمک بالا، DNA با تشکیل یک پل یونی از گروه کربوکسیل یون نمک DNA با مهره ها متصل می شود. این اتصال برگشت پذیر است. پل یونی در بافر TE بدون یون PEG و نمک حذف می شود و در نهایت DNA خالص می شود. بر اساس مهره های مغناطیسی کربوکسیل، ورودی های مختلف مهره های مغناطیسی و بافرهای تصفیه، اندازه های مختلف قطعه را متصل می کنند. دانه های مغناطیسی ترجیحا قطعات بزرگی از DNA را به هم متصل می کنند، بنابراین در دور اول، از مهره های مغناطیسی برای اتصال قطعات بزرگتر از قطعه هدف استفاده می شود و مایع رویی باقی می ماند. در دور دوم، دانه های مغناطیسی قطعه هدف را در مایع رویی متصل می کنند و سپس مایع رویی را دور می اندازند. در نهایت، قطعه هدف از دانه های مغناطیسی، که قطعات DNA به اندازه هدف هستند، شسته می شود.

Carboxyl magnetic bead structure

شکل 1. ساختار مهره مغناطیسی کربوکسیل

Principle of DNA purification magnetic beads

شکل 2. اصل دانه های مغناطیسی خالص سازی DNA

1.2 فرآیند عملیات

DNA purification steps

شکل 3. مراحل خالص سازی DNA

DNA size selection steps

شکل 4. مراحل انتخاب اندازه DNA

1.3 نکاتی برای استفاده از مهره های مغناطیسی

عملکرد بهبود یافته و انتخاب اندازه دقیق

(1) قبل از استفاده خوب مخلوط کنید و متعادل کنید دانه های مغناطیسی را حداقل 30 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید.

- حلالیت PEG در دانه های مغناطیسی بافر به راحتی تحت تاثیر pH و دما قرار می گیرد.قبل از استفاده، لازم است تعادل ایجاد شود به دمای اتاق برای درست کردن دانه های مغناطیسی به طور یکنواخت معلق و PEG به طور کامل حل می شود تا از تأثیرگذاری بر اثرات جذب و جداسازی جلوگیری شود.

(2) زمان جذب باید کافی باشد و کاملاً مخلوط شود برای ایجاد جذب کافی؛

(3) شستشو با اتانول 80% در هنگام تصفیه یا جداسازی؛

——زیر اتانول 80 درصد، اسید نوکلئیک دهیدراته شده و از نزدیک جمع می شود و حل نمی شود. آنزیم های باقیمانده، بافرها، ناخالصی ها و غیره در سیستم با اتانول تمیز می شوند تا خالص تر به دست آید. کتابخانه

(4) در طول انتخاب اندازه، حجم نمونه را تأیید کنید تا مطمئن شوید که نسبت افزودن مهره مغناطیسی صحیح است.

——در طول انتخاب اندازه، لازم است حجم مربوط به دانه های مغناطیسی را به طور دقیق وارد کنید تا نسبت دقیق باشد، زیرا تغییر غلظت PEG و یون نمک در بافر ممکن است بر نتایج تأثیر بگذارد.

(5) قبل از مرحله شستشو، اجازه دهید الکل کاملاً تبخیر شود، اما جلوگیری از مهره ها خشک شدن بیش از حد

——به طور کلی، می توان آن را در 2 تا 3 دقیقه خشک کرد. هنگامی که تعداد دانه های مغناطیسی زیاد است و خشک کردن آنها دشوار است، توصیه می شود در لوله های سانتریفیوژ متعدد کار کنید.

(6) اگر دانه های مغناطیسی آگلومره یا دال دار باشند، زمان شستشو قابل تمدید است پس از مخلوط کردن کامل؛

——ممکن است ناشی از ناخالصی های موجود در DNA یا زمان خشک شدن خیلی طولانی به طور کلی، زمانی که ناخالصی های زیادی در DNA وجود دارد، توصیه می شود ابتدا آن را خالص کنید قبل از انتخاب اندازه

2. معرفی دانه های DNA ستاره

دانه‌های انتخاب DNA Hieff NGS™ بر اساس اصل SPRI (تحرک معکوس فاز جامد)، با استفاده از مواد خام دانه‌های مغناطیسی وارداتی، و یک سیستم بافر بهینه‌سازی شده است که می‌تواند برای انتخاب اندازه قطعه DNA و خالص‌سازی در طول ساخت کتابخانه NGS استفاده شود. از آن به همان روشی که دانه‌های AMPure XP استفاده می‌شود استفاده می‌شود و کارایی بازیابی قطعه و توزیع اندازه کتابخانه بسیار با آنها سازگار است.

2.1 معرفی عملکرد تصفیه

  • سیستم بافر منحصر به فرد: قطعات DNA به پایین 50bp قابل بازیابی است.
  • نرخ بازیابی بالا: ≥90٪.
  • حذف موثر ناخالصی ها: به طور موثر ناخالصی هایی مانند دایمر پرایمر، dNTP، نمک معدنی و پروتئین را حذف کنید.
  • محدوده کاربرد گسترده: برای خالص سازی DNA در سناریوهایی مانند هضم آنزیمی، بستن، شبیه سازی و ساخت کتابخانه NGS مناسب است.

جدول 1. راندمان خالص سازی و بازیابی DNA دانه های مغناطیسی با نسبت های مختلف

گروه تجربه غلظت بازیابی دانه های مغناطیسی در این دسته (ng/μL) نرخ بازیابی AMPure XP beads Group (ng/μl) ④ نرخ بازیابی CV%
نسبت ① ② ③ میانگین
1.8× 22.2 23.4 22.8 22.8 96.92% 22.2 94.37٪ 2.55٪
0.8× 20.2 19.3 18.5 19.33 82.19٪ 17.8 75.67٪ 6.52٪
0.6× 16.3 17.3 16.8 16.8 71.42% 16.2 68.87٪ 2.55٪

شکل 5. اثر خالص سازی دانه های مغناطیسی ژل آگارز نتایج الکتروفورز

M: نردبان DNA 1 کیلوبایتی؛

2.2 عملکرد انتخاب اندازه

  • آسان به عمل: اصل جداسازی و عملیات آزمایشی کاملاً با مهره های مغناطیسی XP سازگار است
  • انتخاب اندازه دقیق: اندازه قطعات مرتب شده دقیق و پایدار است
  • کاربرد گسترده: مناسب برای ساختمان کتابخانه های DNA و RNA و سازگاری برای انتخاب اندازه قطعه از انواع مختلف نمونه
  • عملکرد هزینه بسیار بالا: کیفیت پایدار، قیمت مقرون به صرفه تر، پیش فروش دقیق و خدمات پس از فروش

DNA Size selection results

شکل 6. نتایج انتخاب اندازه DNA

3. دانه های خالص سازی RNA

پاک کننده RNA Hieff NGS™ بر اساس اصل SPRI است که می تواند به طور موثر پروتئین ها، یون های نمک و سایر ناخالصی ها را برای به دست آوردن نمونه های RNA غلیظ با خلوص بالا حذف کند و با دقت سیستم بافر اسیدی را برای حفظ ثبات ساختار RNA و جلوگیری از تخریب RNA بهینه کند. این برای ساخت کتابخانه RNA، خالص سازی نمونه های RNA کل پس از حذف rRNA، خالص سازی محصولات RNA رونویسی شده در شرایط آزمایشگاهی، خالص سازی محصولات دارای برچسب RNA، خالص سازی RNA مصنوعی و غیره مناسب است.

  • کیفیت بالا: مواد خام وارداتی، کیفیت بسیار پایدار
  • سیستم بافر بهینه: از خلوص و یکپارچگی RNA اطمینان حاصل می کند و به طور موثر از تخریب RNA جلوگیری می کند.
  • راندمان بالا: بازیابی کارآمد، مناسب برای ساخت کتابخانه RNA یا در شرایط آزمایشگاهی بازیابی محصول رونویسی و غیره

شکل 7. الکتروفورتوگرام نمونه های مختلف پس از خالص سازی

4. دانه های مغناطیسی غنی شده با mRNA

4.1 اصل جداسازی mRNA

دانه‌های مغناطیسی جداسازی و غنی‌سازی mRNA، دانه‌های مغناطیسی هستند که سطح آن با الیگو (dT) اصلاح شده است. از طریق اصل هیبریداسیون، آنها می توانند به طور خاص mRNA را با دم Poly A متصل کنند و به طور خاص mRNA را از RNA کل یا سلول های بافتی جدا کنند. این کیت با فرمول محصول بهینه شده می تواند به طور موثر mRNA کامل با خلوص بالا را از RNA سلول ها و بافت های حیوانات، گیاهان، حشرات و میکروارگانیسم های یوکاریوتی جدا کند.

principle of enrichment and purification of mRNA magnetic beads

شکل 8.اصل غنی سازی و خالص سازی مهره های مغناطیسی mRNA

4.2 عملکرد دانه های جداسازی mRNA

کیت اصلی جداسازی mRNA Hieff NGS™ به طور مستقل توسط Yeasen برای جداسازی mRNA از RNA کل توسعه یافته است. مهره های جذب mRNA میکروسفرهای پارامغناطیس با اندازه میکرون هستند که با الیگو (dT) اصلاح شده اند. با ترکیب با mRNA با دم پلی (A)، mRNA جدا شده و از 10 نانوگرم-4 میکروگرم RNA کل با یکپارچگی خوب خالص می‌شود.

  • راندمان بالا: خالص سازی mRNA را می توان در عرض 45 دقیقه تکمیل کرد
  • خلوص بالا: دانه های مغناطیسی الیگو (dT) به طور خاص mRNA را متصل می کنند
  • قابل اعتماد: mRNA بدست آمده برای NGS، در شرایط آزمایشگاهی مناسب است ترجمه، RT-PCR، و سنتز cDNA

mRNA isolation kit purification of mRNA from different RNA samples

شکل 9. خالص سازی کیت جداسازی mRNA از mRNA از نمونه های مختلف RNA

توجه: بازده ژن خانه داری نشان دهنده اثر بازیابی mRNA است. بازده ژن مرتبط با rRNA شناسایی کارایی حذف rRNA

4.3 سوالات متداول مهره مغناطیسی mRNA

(1) چرا دانه های مغناطیسی آگلومره می شوند و چگونه آن را حل کنیم؟

——مهره های مغناطیسی تجمع باعث کاهش بازده و خلوص mRNA می شود. نمونه ممکن است حاوی ناخالصی های زیادی مانند پلی ساکاریدها، پروتئین ها و DNA با زنجیره بلند باشد. این ناخالصی ها منجر به ایجاد دانه های مغناطیسی می شوند تجمع راه حل این است که مهره های مغناطیسی را از طریق یک پیپت دمیده کنید. DNA ژنومی را می توان با تیمار DNase قبل از خالص سازی حذف کرد. اگر اندازه نمونه اولیه خیلی بزرگ باشد و از بار مهره های مغناطیسی بیشتر باشد، دانه های مغناطیسی نیز تجمع می یابند. توصیه می شود طبق مقدار ورودی در دفترچه راهنما عمل کنید.

(2) چرا بازده mRNA کم است؟

- دلایل زیادی برای بازده mRNA پایین وجود دارد:

  • سطح بیان mRNA سلول ها یا بافت ها پایین است، بنابراین می توانیم نمونه های دوره بیان مناسب را انتخاب کنیم یا مقدار ورودی RNA کل نمونه را به طور مناسب افزایش دهیم.
  • نسبت مهره های مغناطیسی به نمونه ها بسیار کم است که بر ترکیب mRNA و دانه های مغناطیسی تأثیر می گذارد. سعی کنید افزایش دهید تعداد مهره های مغناطیسی یا کاهش مقدار و حجم ورودی نمونه.
  • زمان هیبریداسیون بسیار کوتاه است، زمان انکوباسیون را می توان به 10-15 دقیقه افزایش داد.
  • شستشو کافی نیست، باید حجم بافر شستشو را به طور مناسب افزایش داد، زمان و دمای شستشو را افزایش داد یا مرحله شستشو را دو بار تکرار کرد.

(3) چگونه به طور موثر rRNA را حذف کنیم؟

——اگر عملیات نامناسب باشد، rRNA در طول خالص سازی به دانه های مغناطیسی به همراه mRNA متصل می شود. به خصوص زمانی که مقدار زیادی از ورودی RNA کل وجود دارد. معمولاً در فرآیند تصفیه از دو دور اتصال استفاده می شود برای جلوگیری موثر از آلودگی rRNA. اطمینان حاصل کنید که در طول آزمایش شستشو کاملاً مخلوط شده است تا اتصال غیر اختصاصی حذف شود و سعی کنید آلودگی rRNA را حذف کنید.

(4) برای بسیاری از کاربردهای پایین دست، آیا شستشوی mRNA ضروری است و آیا دانه های مغناطیسی با واکنش های آنزیم پایین دست تداخل می کنند؟

——برخی از واکنش های پایین دست را می توان مستقیماً با دانه های مغناطیسی بدون شستشوی mRNA ها انجام داد، مانند تکه تکه شدن mRNA و رونویسی معکوس در ساختمان کتابخانه RNA.با این حال، اگر قرار باشد واکنش‌های PCR انجام شود، باید اطمینان حاصل شود که آلودگی DNA ژنومی وجود ندارد، در غیر این صورت قطعات تکثیر ژنومی زیادی تولید می‌شود که با نتایج تجربی تداخل خواهد داشت. عملیات دقیق را می توان با توجه به دستورالعمل های واکنش های پایین دست مربوطه، مانند ساخت کتابخانه RNA-Seq انجام داد.

(5) آیا کیت می تواند mRNA را مستقیماً از سلول ها یا بافت ها جدا کند؟

——توصیه نمی شود! لیز حاوی اجزایی است که بر اتصال mRNA تأثیر می گذارد. توصیه می شود از کیت مخصوص استفاده کنید.

5. توصیه محصول دانه های مغناطیسی Yeasen

دانه های مغناطیسی سری Hieff NGS™ به عنوان محصولات ستاره Yeasen دارای عملکرد عالی و ظرفیت تولید بالا برای پاسخگویی به کاربردهای مختلف هستند و به طور یکپارچه جایگزین دانه های Beckman AMPure XP می شوند. دانه های مغناطیسی Yeasen از زمان عرضه آن در سال 2018، شهرت خوبی در صنعت به دست آورده اند و فروش همچنان رو به افزایش بوده است. آنها بهترین انتخاب برای کیفیت خوب و قیمت پایین هستند.

جدول 2. توصیه محصول دانه های مغناطیسی Yeasen

نام محصول گربه# مشخصات سناریوهای استفاده و کاربرد
Hieff NGS™ مهره های انتخاب DNA 12601ES03 1 میلی لیتر 👉DNA NGS تصفیه و انتخاب اندازه 👉تصفیه محصول PCR 👉تصفیه محصولات هضم و بستن آنزیمی
12601ES08 5 میلی لیتر
12601ES56 60 میلی لیتر
12601ES75 450 میلی لیتر
Hieff NGS™ پاک کننده RNA 12602ES03 1 میلی لیتر 👉خالص سازی RNA 👉خالص سازی نمونه های RNA کل پس از حذف rRNA 👉خالص سازی محصولات دارای برچسب RNA
12602ES08 5 میلی لیتر
12602ES56 60 میلی لیتر
12602ES75 450 میلی لیتر
کیت اصلی جداسازی mRNA Hieff NGS™ 12603ES24 24 ت 👉جداسازی و خالص سازی mRNA 👉خالص سازی mRNA رونویسی در شرایط آزمایشگاهی
12603ES96 96 ت

در مورد ریدینگ

در مورد فناوری مرتبط با NGS، چقدر می دانید؟

5 دقیقه برای درک گذشته و حال دانه های انتخاب DNA (از جمله تجزیه و تحلیل نتایج و تفسیر سوالات متداول)

تحقیق