Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit یک کیت مهره مغناطیسی است که مخصوص خالص سازی mRNA است. مهره‌های mRNA Capture میکروکره‌های پارامغناطیسی با اندازه میکرومتر هستند که با دم‌های Oligo dT (پلی A) همراه شده‌اند، که می‌توانند برای جداسازی mRNA از 10 نانوگرم تا 4 میکروگرم RNA کامل با اتصال به mRNA با دم‌های پلی A استفاده شوند.

مشخصات

اجزاء

ذخیره سازی

این محصول باید به مدت یک سال در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد نگهداری شود و از یخ زدن خودداری شود.

دستورالعمل ها

1. مواد مورد نیاز گنجانده نشده است

رک مغناطیسی، لوله های PCR بدون هسته

2. عملیات

1) MRNA Capture Beads را متعادل کنید در دمای اتاق (~ 30 دقیقه).

2) 10 نانوگرم – 4 میکروگرم RNA کل را با آب بدون نوکلئاز در یک لوله PCR بدون نوکلئاز به 50 میکرولیتر رقیق کرده و روی یخ قرار دهید.

3) دانه های مغناطیسی را با وارونه کردن یا چرخاندن مخلوط کنید. 50 میکرولیتر از دانه های مغناطیسی را به 50 میکرولیتر نمونه RNA کل اضافه کنید و 6 بار پیپت کنید تا خوب مخلوط شوند. برای مدت کوتاهی به سمت پایین لوله بچرخید.

4) مخلوط دانه های مغناطیسی و RNA را در یک سیکلر حرارتی انکوبه کنید و برنامه زیر را اجرا کنید: 65 درجه سانتیگراد، 5 دقیقه. 25 درجه سانتیگراد، 5 دقیقه; 25 درجه سانتیگراد، نگه دارید.

5) لوله را روی یک مغناطیسی قرار دهید قفسه به مدت 5 دقیقه mRNA را از RNA کل جدا کنید. مایع رویی را با دقت خارج کنید.

6) لوله را از مغناطیسی خارج کنید قفسه و دوباره مهره های مغناطیسی را با 200 میکرولیتر Beads Wash Buffer معلق کنید. کل ولوم را 6 بار پیپت کنید تا کاملا مخلوط شود. لوله را روی یک مغناطیسی قرار دهید قفسه به مدت 5 دقیقه، و مایع رویی را با دقت خارج کنید.

7) مرحله 6 را تکرار کنید.

8) لوله را از مغناطیسی خارج کنید قفسه. 50 میکرولیتر Tris Buffer را اضافه کنید تا دانه های مغناطیسی مجدداً معلق شوند و 6 بار پیپت کنید تا کاملا مخلوط شوند.

9) نمونه را در یک سیکلر حرارتی قرار دهید و برنامه زیر را برای شستشوی mRNA اجرا کنید: 80 درجه سانتیگراد، 2 دقیقه. 25 درجه سانتیگراد، نگه دارید.

10) نمونه را از چرخه حرارتی خارج کنید. 50 میکرولیتر Beads Binding Buffer را اضافه کنید و 6 بار پیپت کنید تا کاملا مخلوط شود.

11) در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه جوجه کشی کنید تا mRNA به دانه های مغناطیسی متصل شود.

12) لوله را روی مغناطیسی قرار دهید به مدت 5 دقیقه نگه دارید و مایع رویی را با دقت خارج کنید.

[توجه]: یک پیپت 10 میکرولیتری برای آسپیره کردن مایع باقیمانده مورد نیاز است.

13) لوله را از مغناطیسی خارج کنید قفسهدانه های مغناطیسی را با 200 میکرولیتر Beads Wash Buffer مجدداً معلق کنید، 6 بار پیپت کنید تا کاملاً مخلوط شود. لوله را روی مغناطیسی قرار دهید قفسه در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه. تمام مایع رویی را بردارید و دور بریزید.

14) شستشوی نهایی mRNA

طرح الف: برای واکنش رونویسی ذخیره

لوله را بردارید از مغناطیسی قفسه. 12 میکرولیتر آب بدون هسته اضافه کنید و 6 بار پیپت کنید تا کاملا مخلوط شود. لوله را در سیکلر حرارتی قرار دهید برنامه زیر را اجرا کنید: 80 درجه سانتیگراد، 2 دقیقه. سپس لوله را روی مغناطیسی قرار دهید قفسه بلافاصله به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید. پس از شفاف شدن محلول، 10 میکرولیتر از مایع رویی را با دقت در یک لوله PCR جدید بدون نوکلئاز آسپیره کنید.

طرح B: برای RNA آماده سازی کتابخانه

کیت 12603 همراه با کیت 12308 استفاده می شود. لطفا به محصول مراجعه کنید:

Hieff NGS™ Ultima Dual-Mode mRNA Library Prep Kit -12308ES

حجم مناسب بافر Frag/Primer را طبق دستورالعمل کیت مربوطه برای ساخت کتابخانه اضافه کنید.

توجه داشته باشید

1. برای ایمنی و سلامتی خود، لطفا از کت های آزمایشگاهی و دستکش های یکبار مصرف برای عمل استفاده کنید.
2. فقط برای استفاده تحقیقاتی
3. قبل از استفاده از دانه های مغناطیسی حتماً تا دمای اتاق گرم شده و خوب مخلوط کنید، در غیر این صورت ممکن است راندمان بازیابی نمونه ها تحت تأثیر قرار گیرد.
4. عمل باید کاملاً عاری از آلودگی RNase و اسید نوکلئیک باشد.
5. هنگامی که این محصول با سایر معرف ها استفاده می شود، لطفاً دستورالعمل های آزمایشی خاص را برای عملکرد دنبال کنید.
6. برای به دست آوردن نتایج تصفیه خوب، باید یکپارچگی RNA کل را داشته باشید و از مقدار RIN > 7.0 اطمینان حاصل کنید.