کمی‌سازی اسید نوکلئیک به‌عنوان یکی از اساسی‌ترین آزمایش‌ها در زیست‌شناسی مولکولی، مستقیماً بر نتایج آزمایش‌های پایین‌دست تأثیر می‌گذارد. دقت تعیین کمیت اسید نوکلئیک بسیار مهم است. در حال حاضر دو روش اصلی برای کمی سازی کتابخانه NGS وجود دارد، روش جذب اشعه ماوراء بنفش و روش رنگ فلورسنت.

روش جذب اشعه ماوراء بنفش از یک اسپکتروفتومتر برای اندازه گیری جذب در 260 نانومتر برای تعیین کمیت DNA و RNA استفاده می کند. همچنین خلوص اسیدهای نوکلئیک را با محاسبه نسبت OD260/OD280 تخمین می زند. با این حال، مقادیر شناسایی شده بسیار مستعد تداخل سایر آلاینده ها مانند نوکلئوتیدهای آزاد، نمک ها و ترکیبات آلی هستند.

کمی سازی فلورومتری کیوبیت از رنگ های فلورسنتی استفاده می کند که به طور خاص به DNA دو رشته ای، DNA تک رشته ای، RNA یا پروتئین ها متصل می شوند. پس از تحریک توسط یک منبع نور با طول موج خاص، رنگ ها فلورسانس ساطع می کنند که تحت تأثیر مولکول های ناخالصی دیگری که ممکن است در نمونه وجود داشته باشد، قرار نمی گیرد. شدت فلورسانس متناسب با غلظت مولکول های هدف در نمونه است.

جدول 1. مقایسه روشهای اصلی کمی سازی اسید نوکلئیک

هدف	UV Abs (Nanodrop)	کیوبیت DNA HS	کیوبیت DNA BR	کیوبیت RNA	کیوبیت ssDNA
نوع اسید نوکلئیک	DNA، RNA	dsDNA	dsDNA	RNA	ssDNA، الیگو
غلظت نمونه (ng/μL)	2 نانوگرم / میکرولیتر - 15 میکروگرم / میکرولیتر	10 pg/µL-100ng/µL	0.1 ng/µL-1000 ng/µL	250 pg/μl-1000 ng/µl	50 pg/μL-200ng/μL
مزیت	حد بالاتر کمیت	ویژگی خوب	طیف گسترده ای از کمی سازی	بسیار انتخابی برای RNA	خوب تحمل کرد
محدودیت ها	ویژگی ضعیف	در هنگام استفاده از نور محافظت کنید	در هنگام استفاده از نور محافظت کنید	در هنگام استفاده از نور محافظت کنید	ویژگی ضعیف است و همچنین به dsDNA متصل می شود

جذب اشعه ماوراء بنفش و کمیت فلورومتری کیوبیت هر کدام مزایای خود را دارند و می توانند مکمل یکدیگر باشند. برای کمی سازی اولیه نمونه های معمول اسید نوکلئیک برای تعیین غلظت، خلوص و وجود آلاینده ها، روش کمی جذب می تواند انتخاب شود. کمی سازی کیوبیت برای نمونه های گرانبها با غلظت پایین یا تعیین کمیت دقیق مورد نیاز برای آزمایش های پایین دستی، مانند توالی یابی نسل بعدی و PCR کمی در زمان واقعی، مناسب تر است.

Yeasen چندین محصول کمی سازی Qubit را راه اندازی کرده است: dsDNA HS Assay Kit برای Qubit^® (Cat#12640)، آماده استفاده: 1× dsDNA HS Assay Kit برای Qubit^® (Cat#12642)، کیت سنجش ssDNA برای کیوبیت^® (Cat#12645) و dsDNA BR Assay Kit (Cat#12643)، که از زمان راه اندازی به طور گسترده مورد تحسین قرار گرفته اند.

راه حل 1 dsDNA HS کمی حساسیت بالا

پیش میکس کمی dsDNA آماده استفاده — کیت سنجش dsDNA HS 1× برای کیوبیت^®

^{عملکرد آسان: پیش مخلوط آماده برای استفاده، بدون نیاز به پیش اختلاط.}

^{حساسیت بالا: غلظت قابل تشخیص به اندازه 50 pg/μL.}

^{پایداری خوب: سیگنال فلورسانس به مدت 3 ساعت طول می کشد و ذخیره سازی در دمای اتاق به مدت 20 روز بر دقت کمی تأثیر نمی گذارد.}

^{A.Superb پایداری: ذخیره سازی در دمای اتاق به مدت 2 هفته همچنان پایداری خود را حفظ می کند (مقدار اندازه گیری شده کمتر از 10٪ از مقدار نظری انحراف دارد).}

جدول 2. تست پایداری نمونه های مختلف در 4 درجه سانتی گراد و دمای اتاق در مقایسه با رقبا

معرف های کمی	تعیین شده است تمرکز λDNA (ng/μL)
	0d		1d		3 بعدی	7d			10 روز		14 روز
T* 4℃	0.51		0.496		0.524	0.534			0.495		0.499
Yeasen 4℃	0.51		0.508		0.513	0.475			0.48		0.495
Yeasen دمای اتاق ذخیره سازی	0.51		0.517		0.506	0.486			0.506		0.523
معرف های کمی	تعیین شده است تمرکز gDNA گوساله (ng/μL)
	0d	1d		3 بعدی			7d	10 روز		14 روز
T* 4℃	55.3	53.5		55.40			57.9	55.8		58
Yeasen 4℃	59.4	55.4		57.8			56.1	56.3		59.8
Yeasen دمای اتاق ذخیره سازی	59	55.7		61.3			58	58.7		56.1

B.حساسیت بالا، پایداری خوب دسته به دسته

جدول 3.تست پایداری دسته های مختلف

بچسباندن	نمونه	L*			Yeasen			خطا
		غلظت 1 (ng/μL)	غلظت 2 (ng/μL)	AVG (ng/μL)	غلظت 1 (ng/μL)	غلظت 2 (ng/μL)	AVG (ng/μL)
D9801060	λDNA	0.3160	0.3250	0.3205	0.320	0.320	0.320	0.16٪
D8801050		0.3310	0.3320	0.3315	0.319	0.306	0.3125	5.73٪
D7813110		0.345	0.358	0.352	0.334	0.329	0.332	-6.03٪

راه حل 2 dsDNA BR کمی محدوده وسیع

طیف وسیعی از کمیت dsDNA - کیت سنجش dsDNA BR

حساسیت بالا: غلظت قابل تشخیص به اندازه 50 pg/μL.

خطی عالی: خطی خوب در محدوده 2-1000 نانوگرم.

تحمل قوی در برابر آلاینده ها: می تواند آلاینده های رایج را تحمل کند.

جدول 4. پایداری و تحمل آلاینده ها در مقایسه با رقبا

Yeasen BR						T* BR
استاندارد	RFU1	RFU2	AVG	خطا		استاندارد	RFU1	RFU2	AVG	خطا
S1	159.63	160.71	160.17	1%		S1	216.17	211.56	213.865	-2٪
S2	24497.0	25078.64	24787.82	2%		S2	20532.46	20452.26	20492.36	0%
قاعدگی						قاعدگی
آلاینده	غلظت در نمونه 10 میکرولیتری	غلظت 1	غلظت 2	AVG	مورد آزمایش/کنترل قرار گیرد	آلاینده	غلظت در نمونه 10 میکرولیتری	غلظت 1	غلظت 2	AVG	مورد آزمایش/کنترل قرار گیرد
کنترل (H2O)	/	49	48.6	48.8	0.0٪	کنترل (H2O)	/	49.8	48	48.9	0.0٪
BSA	1 میلی گرم در میلی لیتر	51.8	52	51.9	6.4٪	BSA	1 میلی گرم در میلی لیتر	54	51.2	52.6	7.6٪
اتانول	20%	44.6	44	44.3	-9.2٪	اتانول	20%	44.8	43.4	44.1	-9.8٪
کلروفرم	4.00٪	49.0	49.8	49.4	1.2٪	کلروفرم	4.00٪	50.0	47	48.5	-0.8٪
SDS	0.2٪	46.6	45.8	46.2	-5.3٪	SDS	0.2٪	53.2	51.6	52.4	7.2٪
Trition-X100	0.20٪	41.6	40.6	41.1	-15.8٪	Trition-X100	0.20%	53	51	52.0	6.3٪
dNTP ها	2 میلی متر	44.2	45	44.6	-8.6٪	dNTP ها	2 میلی متر	47.8	46.4	47.1	-3.7٪

راه حل 3 تعیین کمیت ssDNA

انتخاب ایده آل برای تعیین کمیت ssDNA - کیت سنجش ssDNA با کارایی بالا برای Qubit^®

^{حساسیت بالا: غلظت قابل تشخیص به اندازه 50 pg/μL.
خطی عالی: خطی بودن خوب در محدوده 0-200 نانوگرم.
سیگنال پایدار: رنگ عالی همراه با بافر بهینه سازی شده ارتقا یافته، می تواند شدت فلورسانس را در دمای اتاق ثابت نگه دارد و حتی در محیط های آلوده معمولی مانند نمک ها، نوکلئوتیدهای آزاد، حلال ها، مواد شوینده یا پروتئین ها بسیار قابل استفاده است و از تعیین کمیت دقیق اطمینان می دهد.
پایداری خوب: هیچ تغییر قابل توجهی در عملکرد پس از 6 ماه درمان در دمای 4 درجه سانتیگراد یا 25 درجه سانتیگراد وجود ندارد.
دامنه کاربرد گسترده: فرآیند عملیات ساده، امکان تعیین کمیت سریع اولیگونوکلئوتیدها، آغازگرها، DNA دناتوره شده، DNA دایره ای تک رشته ای و غیره را فراهم می کند.}

الف. تکرارپذیری خوب: کمی سازی در ابزارهای مختلف کیوبیت، انواع مختلف نمونه ها با استفاده از Yeasen چندین دسته از Cat#12645 آزمایش شده است. در محدوده 0-200ng، تکرارپذیری خوب در اندازه‌گیری‌های ابزارهای مختلف کیوبیت.