کیت آنالیز قطعه DNA باقیمانده سلول میزبان HEK293 برای این طراحی شده است تجزیه و تحلیل کمی قطعات DNA باقیمانده HEK293 با طول های مختلف در محصولات واسطه، نیمه تمام و محصولات نهایی آماده سازی بیولوژیکی. این کیت از اصل پروب فلورسانس qPCR برای تشخیص سریع و اختصاصی بقایای DNA HEK293 در زیر و بالاتر از 200 جفت باز، با محدودیت کمی تا 10 fg/μL استفاده می کند. همچنین شامل کنترل DNA HEK293 (مرجع کمی DNA) است. این کیت را می توان همراه با کیت های آماده سازی نمونه DNA باقیمانده مبتنی بر مهره مغناطیسی این شرکت استفاده کرد (Cat#18461ES/18462ES).

اطلاعات محصول

جزء

ذخیره سازی و حمل و نقل:

1. همه اجزا بر روی یخ خشک حمل می شوند و باید در دمای -25 تا -15 درجه سانتیگراد پس از دریافت نگهداری شوند. ماندگاری 2 سال است. اجزای A و B1، B2، B3 و B4 باید در محافظت از نور نگهداری شوند.

2. پس از دریافت، بررسی کنید که همه 7 جزء موجود هستند و بلافاصله آنها را در دمای توصیه شده ذخیره کنید.

موارد احتیاط:

1. این محصول فقط برای اهداف تحقیقاتی در نظر گرفته شده است.

2. به دلایل ایمنی و بهداشتی، لطفاً در حین کار از روپوش آزمایشگاهی و دستکش یکبار مصرف استفاده کنید.

3. قبل از استفاده از این معرف، دفترچه راهنما را به دقت مطالعه کنید. آزمایش‌ها باید طبق روش‌های استاندارد، از جمله جابجایی نمونه، آماده‌سازی مخلوط‌های واکنش، و پیپت کردن انجام شوند.

4. هر جزء باید با تکان دادن ملایم کاملاً مخلوط شده و قبل از استفاده برای مدت کوتاهی سانتریفیوژ شود.

ابزارهای سازگار:

شامل اما نه محدود به ابزارهای زیر: Thermo Scientific: ABI 7500، ABI Quant Studio 5، ABI Step OnePlus، Bio-Rad: ماژول نوری CFX96، فناوری پزشکی شانگهای هونگشی: SLAN-96S

دستورالعمل استفاده

1. رقیق سازی مرجع کمی کنترل DNA HEK293 و تهیه منحنی های استاندارد

کیت آنالیز قطعه HEK293 شامل چهار قطعه تقویتی با طول های مختلف است: 82 جفت باز، 133 جفت باز، 227 جفت باز و 515 جفت باز. هنگام ایجاد منحنی های استاندارد، منحنی های جداگانه برای هر قطعه تقویتی تنظیم کنید و مقادیر باقیمانده و توزیع نسبی آنها را بر اساس منحنی های استاندارد مربوطه محاسبه کنید.

از بافر رقت DNA ارائه شده در کیت برای انجام رقت شیب مرجع کمی کنترل DNA HEK293 استفاده کنید. غلظت رقت باید: 3 ng/μL، 300 pg/μL، 30 pg/μL، 3 pg/μL، 300 fg/μL و 30 fg/μL باشد..

جزئیات به شرح زیر است

1). کنترل DNA HEK293 و بافر رقت DNA را از کیت روی یخ قرار دهید تا ذوب شود. پس از ذوب کامل، به آرامی ورتکس کنید تا مخلوط شود و برای مدت کوتاهی (10 ثانیه) سانتریفیوژ کنید تا محلول در انتهای لوله جمع شود.

2). شش لوله سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری تمیز تهیه کنید و آنها را با نام های Std0، Std1، Std2، Std3، Std4 و Std5 برچسب گذاری کنید.

3). در لوله ای با برچسب Std0، 90 میکرولیتر بافر رقت DNA و 10 میکرولیتر از کنترل DNA HEK293 اضافه کنید تا به غلظت 3 نانوگرم بر میکرولیتر برسید. به آرامی ورتکس کنید تا مخلوط شود و به طور خلاصه (10 ثانیه) سانتریفیوژ شود. این غلظت را می توان برای استفاده کوتاه مدت (تا 3 ماه) در دمای 20- درجه سانتی گراد ذخیره کرد. از تکرار چرخه های انجماد و ذوب خودداری کنید.

4). در لوله هایی که دارای برچسب Std0، Std1، Std2، Std3، Std4 و Std5 هستند، ابتدا 90 میکرولیتر از بافر رقت DNA به هر کدام اضافه کنید. هر مرحله رقیق سازی باید به آرامی مخلوط شده و برای اطمینان از یکنواختی به مدت کوتاهی سانتریفیوژ شود. سپس گرادیان را اجرا کنید رقت ها به شرح زیر است:

جدول 1: رقیق سازی گرادیان استاندارد

* برای هر غلظت 3 تکرار انجام دهید. این معرف می تواند در محدوده خطی 300 pg/μL تا 30 fg/μL آزمایش شود. در صورت نیاز، محدوده خطی را می توان به طور مناسب گسترش یا باریک کرد.

** برای کاهش چرخه‌های انجماد و ذوب مکرر و جلوگیری از آلودگی، توصیه می‌شود که کمیت‌سازی DNA را به صورت جزئی و ذخیره کنید. ساستاندارد در -20 درجه سانتیگراد برای اولین استفاده.

*** رقت DNA ذوب شده استفاده نشده را می توان در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد تا 7 روز نگهداری کرد. اگر برای مدت طولانی استفاده نمی شود، آن را در دمای -20 درجه سانتی گراد نگهداری کنید.

**** برای اطمینان از اختلاط کامل الگو، هر رقت گرادیان را به آرامی برای حدود 1 دقیقه تکان دهید.

2. آماده سازی نمونه آزمایشی (TS)

نمونه آزمایشی TS را مطابق با تنظیمات آزمایشی به شرح زیر آماده کنید:

1) 100 میکرولیتر از نمونه آزمایش را بردارید و آن را به یک لوله سانتریفیوژ تمیز 1.5 میلی لیتری اضافه کنید. آن را به عنوان TS علامت گذاری کنید، پیش تیمار نمونه را انجام دهید و t را آماده کنیدo خالصy نمونه آزمایشی

2) برای برآورده کردن نیاز برای تجزیه و تحلیل چهار طول مختلف گسترش به طور همزمان، مقدار نمونه آزمایشی از قبل تیمار شده باید ≥120 میکرولیتر باشد. بنابراین توصیه می شود از هر نمونه 2 لوله برای پیش تیمار تهیه و پس از استخراج، برای استفاده با هم مخلوط کنید.

3. آماده سازی کنترل استخراج منفی (NCS)

NCS کنترل استخراج منفی را مطابق با تنظیمات آزمایشی به شرح زیر آماده کنید:

1) 100 میکرولیتر از محلول ماتریکس نمونه (یا رقت DNA) را بردارید بافر) و آن را به یک لوله سانتریفیوژ تمیز 1.5 میلی لیتری اضافه کنید. آن را به عنوان NCS برچسب گذاری کنید.

2) پیش تیمار نمونه NCS کنترل منفی را همراه با دسته نمونه های آزمایشی انجام دهید و محلول NCS کنترل منفی خالص شده را تهیه کنید.

3) برای برآورده کردن نیاز برای تجزیه و تحلیل چهار طول مختلف گسترش به طور همزمان، مقدار نمونه NCS از قبل تیمار شده باید ≥120 میکرولیتر باشد. بنابراین توصیه می شود از هر نمونه NCS 2 لوله برای پیش تیمار تهیه و پس از استخراج برای استفاده با هم مخلوط شوند.

4. آماده سازی بدون کنترل الگو (NTC)

NTC کنترل بدون الگو را طبق تنظیمات آزمایشی به صورت زیر آماده کنید:

1) بدون کنترل الگو (NTC) به نمونه نیاز ندارد قبل از درمان، و می توان از مرحله تشخیص محتوای DNA باقیمانده با استفاده از qPCR تهیه کرد.

2) برای هر لوله یا چاه، نمونه NTC شامل 20 میکرولیتر مخلوط (یعنی 15 میکرولیتر HEK293 qPCR Mix + 5 میکرولیتر HEK293 Primer & Probe Mix مربوطه) + 10 میکرولیتر بافر رقت DNA است. توصیه می شود برای 3 چاه تکراری به اندازه کافی آماده شود.

5. سیستم واکنش qPCR

جدول 2. سیستم واکنش برای قطعه 82 جفت باز

جدول 3. سیستم واکنش برای 133 قطعه bp

جدول 4. سیستم واکنش برای 227 قطعه bp

جدول 5. سیستم واکنش برای 515 قطعه bp

* برای محاسبه مقدار کل مخلوط مورد نیاز برای این واکنش بر اساس تعداد چاه ها:

مخلوط = (تعداد چاه های واکنش + 2) × (15 + 5) میکرولیتر (برای محاسبه از دست دادن 2 چاه). به طور معمول، 3 چاه تکرار برای هر نمونه تهیه می شود.

** تعداد چاه های واکنش = (5 چاه منحنی استاندارد گرادیان غلظت + 1 عدد کنترل بدون الگو (NTC) + 1 محلول کنترل منفی (NCS) + نمونه آزمایش N (TS)) × 3.

NTC (بدون کنترل الگو): بافر رقت DNA

NCS (محلول کنترل منفی): محلول ماتریکس نمونه یا بافر رقت DNA بعد از نمونه قبل-درمان برای به دست آوردن محلول خالص شده که NCS است.

TS (نمونه آزمایشی): نمونه مورد آزمایش.

***پس از توزیع نمونه ها و آب بندی لوله ها، به طور خلاصه با سرعت کم (10 ثانیه) سانتریفیوژ کنید تا مایع از دیواره های لوله به پایین جمع شود. سپس حداقل 5 ثانیه ورتکس کنید تا کاملا مخلوط شوند. سپس، یک سانتریفیوژ با سرعت پایین دیگر (10 ثانیه) انجام دهید. در صورت وجود حباب، حتما آنها را بردارید.

جدول 6: طرح صفحه مرجع

این مثال نشان می دهدروش تشخیص qPCR برای تجزیه و تحلیل قطعات تکثیر DNA باقیمانده HEK293 است.نمونه های آزمایشی شامل: 5 گرادیان غلظت منحنی استاندارد DNA HEK293، 1 نمونه آزمایش (TS)، 1 محلول کنترل منفی (NCS) و 1 کنترل بدون الگو (NTC) می باشد. اجرای 3 چاه تکراری برای هر نمونه توصیه می شود.

6. پارامترهای برنامه تقویت (Tسهروش مرحله ای) (به عنوان مثال با استفاده از ABI 7500 qPCR Instrument، نرم افزار نسخه 2.0)**

1) یک برنامه خالی جدید ایجاد کنید و "Absolute Quantification" را به عنوان الگوی تشخیص انتخاب کنید.

2) برای چهار طول قطعه تقویتی مختلف، کاوشگرهای تشخیص جدید ایجاد کنید و نام آنها را "HEK293-82"، "HEK293-133"، "HEK293-227"، و "HEK293-515" بگذارید. فلوروفور گزارشگر را به عنوان "FAM" و فلوروفور خاموش کننده را به عنوان "هیچ" انتخاب کنید. رنگ مرجع را برای تشخیص به عنوان "ROX" تنظیم کنید (رنگ مرجع ممکن است بسته به مدل ابزار و عوامل دیگر اضافه شود یا خیر).

3) در پانل "تخصیص هدف(ها) به چاه های انتخاب شده"، فیلد "Task" را برای چاه های منحنی استاندارد به عنوان "Standard" تنظیم کنید و مقادیر مربوطه را در قسمت "Quantity" به عنوان "300000"، "30000"، "3000"، "300"، "30" (نماینده غلظت DNA/μL) اختصاص دهید. چاه‌ها را در قسمت «نام نمونه» به‌عنوان «300 pg/μL»، «30 pg/μL»، «3 pg/μL»، «300 fg/μL»، «30 fg/μL» نام‌گذاری کنید. برای چاه های NTC، "Task" را روی "NTC" تنظیم کنید. برای چاه های NCS و TS، "Task" را روی "Unknown" تنظیم کنید و نام چاه ها را "NCS" و "TS" در قسمت "Sample Name" بگذارید. پس از تنظیم این پارامترها، روی "شروع اجرا" کلیک کنید تا اجرای ابزار شروع شود.

4) تنظیمات برنامه تقویت: برنامه تقویت سه مرحله ای را با حجم واکنش 30 میکرولیتر تنظیم کنید.

جدول7. روش PCR

7. تجزیه و تحلیل نتایج qPCR

1) در پانل "Analysis" در زیر "Amplification Plot"، سیستم به طور خودکار "Threshold" را تنظیم می کند. گاهی اوقات، «آستانه» پیش‌فرض خیلی به خط مبنا نزدیک است و باعث ایجاد تغییرات قابل توجه Ct بین تکرارها می‌شود. می توانید به صورت دستی "آستانه" را در یک موقعیت مناسب تنظیم کنید و روی "Analyze" کلیک کنید. در این مرحله، می‌توانید منحنی‌های تقویت را در «نقشه چند جزیی» بررسی کنید تا ببینید آیا آنها عادی هستند یا خیر.

2) در پانل "Analysis" در زیر "Standard Curve"، می‌توانید R²، راندمان تقویت (Eff%)، شیب و قطع منحنی استاندارد را بخوانید. برای یک منحنی استاندارد معمولی: R² > 0.99، راندمان تقویت (90٪ ≤ Eff٪ ≤ 110٪)، و شیب بین -3.6 و -3.1.

3) در پانل «تجزیه و تحلیل» در زیر «نمایش جدول چاه»، می‌توانید ستون «کمیت» را برای کنترل بدون الگو (NTC)، کنترل منفی (NCS) و نمونه‌های آزمایشی (TS) با واحد در fg/μL بخوانید. واحدها را می توان بعداً در گزارش تبدیل کرد.

4) تنظیمات پارامتر برای تجزیه و تحلیل نتایج باید به مدل ابزار خاص و نسخه نرم افزار بستگی داشته باشد. معمولاً ابزار می تواند به طور خودکار نتایج را تفسیر کند.

5) مقدار Ct کنترل منفی (NCS) باید از میانگین مقدار Ct کمترین غلظت منحنی استاندارد بیشتر باشد.

6) نتیجه کنترل بدون الگو (NTC) باید "نامشخص" باشد یا دارای مقدار Ct ≥ 32 باشد.

سند

دستی