Qu'est-ce que l'auréobasidine A
L'auréobasidine A (AbA) est un antibiotique peptidique cyclique isolé du champignon filamenteux Aureobasidium pullulans No. R106, qui possède de fortes propriétés antifongiques et peut être toxique pour les levures à de faibles concentrations (0,1-0,5 μg/mL). Le mécanisme d'action de l'AbA repose sur l'inhibition de l'activité de l'inositol phosphorylcéramide synthase (IPC synthase), une enzyme codée par le gène AUR1 chez la levure, qui bloque la synthèse de la céramide en phospholipides d'inositol, ce qui entraîne une carence en sphingolipides, une rupture de la membrane cellulaire et donc la mort de la souche. Les espèces fongiques sensibles à l'AbA comprennent Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans et A. niger.
Figure 1 Formule développée de l'AbA, CAS#127785-64-2
Des recherches ont montré que le gène AUR1 de Saccharomyces cerevisiae et le gène AURA d'Aspergillus nidulans sont homologues, tous deux codant pour la synthase IPC. Par conséquent, les mutations de ces deux gènes peuvent conférer une forte résistance à l'AbA à des souches telles que le gène muté AUR1-C. L'AbA est très approprié comme marqueur de sélection de médicaments pour le dépistage de clones positifs, et il ne nécessite pas d'optimisation des conditions, avec un bruit de fond très faible. La résistance à l'AbA est également un indicateur idéal pour les études d'hybrides simples/doubles de levure et est compatible avec les systèmes hybrides de levure porteurs de la résistance correspondante.
Qu'est-ce que le système hybride simple/double de levure
Le système à double hybride de levure (Yeast two-hybrid assay) a été créé par Fields et Song et d'autres sur la base des caractéristiques de la régulation transcriptionnelle eucaryote. Il peut analyser rapidement et directement les interactions entre protéines connues et est largement utilisé dans l'étude des interactions antigène-anticorps, la découverte de nouvelles protéines et de nouvelles fonctions protéiques, le criblage de cibles médicamenteuses et l'établissement de cartes de liaison protéique génomique. Le principe du double hybride de levure est que l'activateur transcriptionnel des eucaryotes contient deux domaines structurels différents : le domaine de liaison à l'ADN (DNA binding domain, DNA-BD) et le domaine d'activation de la transcription de l'ADN (Activation domain, AD), qui peuvent être séparés indépendamment sans affecter la fonction de l'autre. BD et AD seuls ne peuvent pas activer la réponse transcriptionnelle, ce n'est que lorsque les deux sont suffisamment proches spatialement qu'ils présentent l'activité d'un activateur transcriptionnel complet, permettant la transcription du gène en aval. En construisant des plasmides de fusion des deux protéines étudiées (protéine X et protéine Y) avec respectivement les domaines BD et AD et en les exprimant dans la même cellule de levure, s'il n'y a pas d'interaction entre les deux protéines, le gène rapporteur ne sera pas transcrit ; si les deux protéines interagissent, les domaines BD et AD seront spatialement proches, ainsi le gène rapporteur est transcrit.
Figure 2 Schéma de principe du double hybride de levure [1]
La technologie de l'hybride simple de levure est un outil d'étude des interactions acide nucléique-protéine, développé sur la base de l'hybride double de levure, et est largement utilisé pour étudier la régulation de l'expression des gènes dans les cellules eucaryotes, comme l'identification de l'interaction entre l'ADN connu et les protéines connues ; l'isolement de nouvelles protéines qui se lient à l'élément cis-régulateur cible ou à d'autres sites de liaison à l'ADN courts ; la localisation précise des sites de liaison à l'ADN dont l'interaction a été prouvée et l'analyse des domaines de liaison à l'ADN des protéines. Son principe de base est de construire l'élément cis-agissant connu en amont du promoteur le plus basique (promoteur minimal, Pmin) et de connecter le gène rapporteur en aval de Pmin. L'ADNc codant pour le facteur de transcription à tester est fusionné avec le vecteur d'expression du domaine AD de levure et introduit dans les cellules de levure.Si le produit de ce gène peut se lier à l’élément cis-agissant, il peut activer le promoteur Pmin, permettant ainsi l’expression du gène rapporteur.
Figure 3 Schéma de principe d'un hybride simple de levure [2]
Pour les études sur les hybrides simples/doubles de levure, Yeasen propose des produits 60231ES Auréobasidine A (AbA), une solution d'AbA dissoute dans du méthanol avec une pureté ≥ 97 % et une concentration de 1 mg/mL. Yeasen recommande une concentration inhibitrice d'AbA de 100 à 1 000 ng/mL dans les expériences d'hybridation simple/double de levure, et la concentration de travail spécifique dépend de la sensibilité des cellules hôtes (voir le tableau suivant, Concentrations inhibitrices minimales (CMI) d'AbA pour diverses souches de levure).
| Bsouche bactérienne | Micro (ng/mL) | |
| S.cerevisiae | ATCC9763 (diploïde) | 200-400 |
| SH3328 (haploïde) | 100 | |
| Levure de saké (diploïde) | 100-200 | |
| Levure de shochu (diploïde) | 100 | |
| Levure de bière (triploïde ou tétraploïde) | 100 | |
| Levure de boulanger (diploïde) | 200-400 | |
| Schizo.pombe | JY-745 (monoploïde) | 100 |
| C. albicans | TIMM-0136 (diploïde) | 40 |
| C. tropicalis | TIMM-0324 (diploïde) | 80 |
Cas d'application
Pour étudier le site de liaison de la protéine GmWRKY31 sur le promoteur du gène GmSAGT1, dans l'expérience d'hybridation unique sur levure, la séquence d'ADN cible a été insérée dans le vecteur pBait-AbAi contenant le gène rapporteur d'uracile Ura3, situé en amont du gène AUR1-C. Après transformation de la levure avec le plasmide correspondant, il a été suspendu dans une solution de NaCl à 0,9 % et la DO600 a été ajustée à 0,005. Par la suite, 100 μL de l'échantillon ont été étalés sur des plaques contenant 500 ng/mL d'AbA, inversés et cultivés à 30℃ pendant 3 à 5 jours[3].
Figure 3 Interaction de la protéine GmWRKY31 avec les souches de levure contenant les fragments F16, F20, F73, delF16, delF20 ou delF73.
Articles publiés avec nos réactifs
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li, et al. L'azote intervient dans la période de floraison et l'efficacité d'utilisation de l'azote via les régulateurs floraux chez le riz, Current Biology, Volume 31, numéro 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (SI:10.834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Un réseau de régulation centré sur NnSnRK1 de la fin précoce de la floraison induite par l'ombre chez le lotus, Environmental and Experimental Botany, Volume 221, 2024, 105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (SI:5.7)
Produits connexes
| Nom du produit | Chat# | Spécification |
| Chlorhydrate de ciprofloxacine | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicilline, sel de sodium | 60203ES10/60 | 10/100g |
| Hyclate de doxycycline | 60204ES03/08/25 | 1/5/25g |
| Chloramphénicol, qualité USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Sulfate de kanamycine | 60206ES10/60 | 10/100g |
| Tétracycline HCl Chlorhydrate de tétracycline (USP) | 60212ES25/60 | 25/100g |
| Chlorhydrate de vancomycine | 60213ES60/80/90 | 100 mg/1 g/5 g |
| Sel de sulfate de gentamicine | 60214ES03/08/25 | 1/5/25g |
| Chlorhydrate de spectinomycine | 60215ES08 | 5g |
| Phléomycine (20 mg/mL en solution) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Blasticidine S (Blasticidine) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatine | 60219ES08 | 5g |
| Sulfate de G418 (généticine) | 60220ES03/08 | 1/5g |
| Puromycine (solution 10 mg/mL) | 60209ES10/50/60/76 | 1 × 1 / 5 × 1 / 1 0 × 1 / 50 × 1 mL |
| Dichlorhydrate de puromycine | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500 mg / 1 g |
| Hygromycine B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 g (20 ml)/10 × 1 g (20 ml) |
| Hygromycine B | 60225ES03/10 | 1/10g |
| Érythromycine | 60228ES08/25 | 5/25g |
| Timentine | 60230ES07/32 | 3,2/10×3.2g |
| Auréobasidine A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1mg |
| Sulfate de polymyxine B | 60242ES03/10 | 1/10 MU |
Documentation de référence
[1] Paiano A, et al. Essai de double hybride de levure pour identifier les protéines en interaction. Curr Protoc Protein Sci. 2019 févr. ;95(1):e70.
[2] John S, et al. Essais d'hybride simple sur levure : une perspective historique et technique. Méthodes. 2012 août ;57(4) : 441-447.
[3] Dong H, et al. Analyse du transcriptome des TF WRKY du soja en réponse à l'infection par Peronospora manshurica. Génomique. 2019 déc;111(6):1412-1422.