1 Unprincipe de fonctionnement
L'hygromycine B est un antibiotique aminoglycoside produit par le métabolisme de Streptomyces hygroscopicus, qui inhibe la synthèse des protéines en perturbant la translocation et en favorisant la mauvaise lecture des ribosomes 80S, tuant ainsi les cellules procaryotes et eucaryotes.
Actuellement, il est couramment utilisé pour cribler et maintenir des cellules procaryotes ou eucaryotes contenant un gène de résistance à l’hygromycine.
2 Application
2.1 Cribler et maintenir la culture de cellules procaryotes ou eucaryotes (cellules végétales et cellules de mammifères) transfectées de manière stable avec Hph+vecteursL'Hygromycine B gène de résistance (hyg ou hph) dérivé d'Escherichia coli. code pour l'hygromycine B phosphotransférase, qui convertit l'hygromycine B en un produit phosphorylé biologiquement inactif, détoxifiant ainsi. Compte tenu de ce principe, l'hygromycine B est un marqueur sélectionnable très utile pour cribler et maintenir des cellules procaryotes ou eucaryotes en culture transfectées avec succès avec le gène de résistance à l'hygromycine.
2.2En raison de la différence de mode d'action, l'hygromycine B est souvent utilisée en association avec la généticine G418, la bléomycine et la blasticidine pour cribler des lignées cellulaires transfectées de manière stable avec deux vecteurs différents.L'hygromycine B a un mode d'action différent de celui du G418 (Cat#60220ES) et de la bléomycine (Cat#60257ES) et les blasticidines (Cat#60218ES), il est donc bien adapté à une utilisation en combinaison avec d'autres antibiotiques sélectifs dans des expériences de double sélection.
2.3 Agent antiviral2.4 En tant qu’anthelminthique, il est ajouté à l’alimentation animale et les animaux sont élevés.
2.5 Criblage des cellules transfectées de manière stable
La concentration de travail d'hygromycine B utilisée pour sélectionner les transfectants stables varie en fonction du type de cellule, du milieu, des conditions de croissance et du taux métabolique cellulaire. La concentration recommandée est de 50 à 1 000 μg/mL. Pour la première utilisation du système expérimental, il est recommandé de déterminer la concentration de sélection optimale en établissant une courbe de destruction, c'est-à-dire une courbe dose-réponse. En général, 50 à 500 μg/mL pour les cellules de mammifères ; 20 à 200 μg/mL pour les bactéries/cellules végétales ; 200 à 1 000 μg/mL pour les champignons.
3 Protocole
3.1 Préparation de la solution de conservation (50 mg/mL)
Peser 0,5 g d'hygromycine B et ajouter 10 ml de solution PBS 1×, pH 7,4. Après dissolution complète, filtrer avec un filtre de 0,22 μm pour la stérilisation. Aliquoter la solution stérilisée et conserver à -20℃.
3.2 Concentration de criblage couramment utilisée
La concentration d'hygromycine B de travail pour le criblage des souches stables varie en fonction du type de cellule, du milieu de culture, des conditions de croissance et du taux de métabolisme cellulaire. Il est recommandé d'établir une courbe de destruction (courbe dose-réponse) pour déterminer la concentration de criblage optimale pour la première fois. Généralement, cellules de mammifères : 50-500 μg/mL ; cellules bactériennes/végétales : 20-200 μg/mL ; champignons : 300-1000 μg/mL.
3.3 Établissement de la courbe de mortalité
【Remarque】Afin de sélectionner des lignées cellulaires stables, il est nécessaire de déterminer la concentration minimale d'antibiotiques capables de tuer les cellules hôtes non transfectées. Cela peut être réalisé en établissant une courbe de destruction (courbe dose-réponse). Au moins cinq concentrations doivent être prévues.
1) Jour 1 : Les cellules non transformées sont placées dans une plaque de culture appropriée à une densité cellulaire de 20 à 25 % et cultivées pendant la nuit.【Remarque】La quantité de cellules d'inoculation peut être augmentée pour les cellules nécessitant une densité plus élevée pour détecter la vitalité.
2) Réglez le gradient de concentration dans la plage appropriée en fonction du type de cellule. Les cellules de mammifères peuvent être réglées à 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Diluer la solution d'hygromycine B au 1:10 avec de l'eau déionisée ou un tampon PBS à 5 mg/mL. Puis diluer la solution à la concentration de travail correspondante selon le tableau suivant.
| Concentration finale (μg/mL) | Volume moyen (mL) | Volume d'ajout de 5 mg/mL d'hygromycine B (mL) |
| 50 | 9.9 | 0,1 |
| 100 | 9.8 | 0,2 |
| 250 | 9.5 | 0,5 |
| 500 | 9.0 | 1.0 |
| 750 | 8.5 | 1,5 |
| 1000 | 8.0 | 2.0 |
3) Jour 2 : Remplacer par un milieu fraîchement préparé contenant la concentration correspondante du médicament. Faire trois échantillons parallèles pour chaque concentration.
4) Remplacez par un milieu frais contenant des médicaments tous les 3 à 4 jours.
5) Le comptage des cellules vivantes est effectué à un cycle fixe (par exemple, tous les 2 jours) pour déterminer la concentration appropriée pour empêcher la croissance des cellules non transfectées. Choisissez la concentration minimale qui tue la majorité des cellules dans un nombre idéal de jours (généralement 7 à 10 jours), comme concentration de travail pour le criblage d'une lignée cellulaire stable.
3.4 Criblage de cellules transfectées stables
1) 48 h après la transfection, les cellules ont été repiquées dans un milieu de criblage contenant de l'hygromycine B à une concentration appropriée (directe ou diluée). 【Remarque】Les antibiotiques fonctionnent mieux sur les cellules en division active. Si les cellules sont trop denses, l'antibiotique ne les tuera pas. Divisez les cellules de manière à ce qu'elles ne soient pas confluentes à plus de 25 %.
2) Changer le milieu de dépistage tous les 3-4 jours.
3) Mesurer la formation de colonies cellulaires après 7 jours de dépistage. La formation de colonies peut prendre une semaine ou plus, selon le type de cellule hôte, la transfection et l'efficacité du dépistage.
4) Choisissez 5 à 10 clones résistants et transférez-les dans des plaques de culture cellulaire de 35 mm, puis cultivez-les dans un milieu de criblage contenant du médicament pendant 7 jours.
5) Remplacer par du milieu frais sans médicament pour la culture.
4 Propriétés
L'hygromycine B est une poudre blanche à brun jaunâtre avec une odeur particulière, facilement soluble dans l'eau, le méthanol, l'éthanol, etc., et forme facilement des sels avec de nombreux acides organiques et inorganiques.
5 Stockage des produits
La solution peut être stockée directement à 2~8℃ et peut être stockée pendant plus de 6 mois.
6 Attention
1) Les cellules transfectées avec le gène hph sont résistantes à l'hygromycine et les cellules transfectées expriment le gène de manière stable ou temporaire.
2) Le gène de résistance à l'hygromycine B (hyg ou hph) a été trouvé dans d'autres souches, notamment Streptomyces hygroscopicus et Klebsiella pneumoniae, en plus d'E. Coli.
7 Recommandation de produit
Yeasen fournit Hygromycine B sous deux formes, poudre (1 g/10 g, Cat#60225ES) et solution (50 mg/mL, Cat#60224ES).
| Nom du produit | Chat# | Spécification |
| Hygromycine B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 g (20 ml) |
| 60224ES10 | 10 x 1 g (20 ml) | |
| Hygromycine B | 60225ES03 | 1 g |
| 60225ES10 | 10g |
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[6] Chen J, Huang Y, Tang Z, et al. Dépistage de l'activation transcriptionnelle CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome dans le gène lié à la résistance à la metformine du cancer de la prostate. Biol. du développement des cellules frontales . 2021;8:616332. Publié le 26 janvier 2021. doi:10.3389/fcell.2020.616332 (SI:6.684)
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