L'apoptose désigne généralement une forme de mort cellulaire programmée qui se produit par la régulation des gènes intracellulaires et de leurs produits au cours du développement des cellules ou sous l'action de certains facteurs. L'apoptose joue un rôle important dans le développement et la morphogenèse embryonnaires, la stabilité des populations cellulaires normales dans les tissus, la défense et la réponse immunitaire de l'organisme, les dommages cellulaires et le vieillissement causés par une maladie ou un empoisonnement, ainsi que l'apparition et la progression des tumeurs, et a une signification thérapeutique potentielle.

Les événements de la voie apoptotique se produisent dans une séquence temporelle, c'est-à-dire que les événements se produisent en séquence et conduisent finalement à l'émergence de corps apoptotiques, avec apparition de l'apoptose.

Ses caractéristiques typiques sont les suivantes :

1. Apoptose précoce : modifications de la structure de la membrane cellulaire, éversion de la phosphatidylsérine ;

2. Stade précoce et intermédiaire de l'apoptose : la densité du cytoplasme a augmenté, le potentiel de la membrane mitochondriale a disparu, la perméabilité a changé et le cytochrome C a été libéré dans le cytoplasme ;

3. Apoptose tardive : transduction du signal d’apoptose ;

4. Apoptose tardive : ADN dégradé en fragments de 180 à 200 pb.

Figure 1 : Occurrence et détection d'événements séquentiels dans la voie de l'apoptose

1. Apoptose précoce : Annexine-V/PI double coloration (détection de PS sur la membrane extracellulaire)

Dans les cellules vivantes normales, la phosphatidylsérine (PS) est située sur la face interne de la membrane cellulaire. Lorsque l'apoptose se produit, la membrane cellulaire change et la PS passe de la surface interne de la membrane cellulaire à la surface externe de la membrane cellulaire. L'annexine-V est une protéine de liaison aux phospholipides dépendante du Ca2+ avec un poids moléculaire de 35 à 36 KD, qui peut se lier à la PS avec une affinité élevée. En utilisant l'annexine-V marquée à la fluorescéine (FITC, Alexa fluor488, etc.) comme sonde, les cellules apoptotiques et les cellules vivantes peuvent être identifiées par cytométrie de flux ou microscope à fluorescence.

Le PS des cellules nécrotiques passera également de la surface interne de la membrane cellulaire à la surface externe de la membrane cellulaire. L'annexine V peut également reconnaître le PS à la surface des cellules nécrotiques, de sorte que l'annexine V ne peut pas distinguer les cellules nécrotiques des cellules apoptotiques. De plus, l'iodure de propidine (IP) est un colorant d'acide nucléique, qui peut se lier à l'ADN dans les cellules, et il ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire complète. La membrane cellulaire des cellules apoptotiques précoces et des cellules vivantes est toujours intacte, et le colorant PI ne peut pas pénétrer librement dans la cellule à travers la membrane cellulaire pour se lier à l'ADN, de sorte que le colorant PI ne peut pas marquer les cellules apoptotiques et les cellules vivantes, mais le colorant PI peut se lier à l'ADN dans la cellule à travers la membrane cellulaire des cellules nécrotiques. Le colorant PI dans les cellules mortes émettra une fluorescence rouge après avoir été excité par un laser de 488 nm et sera reçu par le canal correspondant. Par conséquent, l'annexine V et l'IP peuvent être utilisés ensemble pour distinguer les cellules vivantes, les cellules apoptotiques précoces et les cellules nécrotiques.

Figure 2 : Analyse des résultats de cytométrie de flux après double coloration à l'annexine-v/pi

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2. Apoptose précoce : coloration JC-1 (détection des modifications du potentiel de la membrane mitochondriale)

Le processus d'apoptose s'accompagne souvent de la destruction du potentiel transmembranaire mitochondrial, qui est largement considéré comme l'un des premiers événements du processus de cascade apoptotique. Il se produit avant l'apparition des caractéristiques de l'apoptose nucléaire (concentration de chromatine, rupture de l'ADN). Une fois que le potentiel transmembranaire mitochondrial s'effondre, l'apoptose cellulaire est irréversible. L'existence du potentiel transmembranaire mitochondrial permet à certains colorants fluorescents cationiques lipophiles tels que la rhodamine 123, JC-1, JC-10 de se lier à la matrice mitochondriale. L'augmentation ou la diminution de leur fluorescence indique l'augmentation ou la diminution de l'électronégativité de la membrane interne mitochondriale.

JC-1 est largement utilisé pour détecter le potentiel de membrane mitochondriale △ΨM, montrant une accumulation dépendante du potentiel dans les mitochondries. Dans les mitochondries normales, JC-1 s'agrège dans la matrice mitochondriale pour former un polymère qui émet une forte fluorescence rouge (ex = 585 nm, em = 590 nm) ; Dans les cellules apoptotiques, le potentiel transmembranaire mitochondrial s'est dépolarisé, le JC-1 a été libéré des mitochondries, la concentration a diminué et est passé à la forme monomère émettant une fluorescence verte. Par conséquent, le changement de couleur reflète directement le changement du potentiel de la membrane mitochondriale. Le degré de dépolarisation mitochondriale peut également être mesuré par le rapport d'intensité de fluorescence rouge/vert. La détection du JC-1 est une méthode courante.

3. Apoptose tardive : méthode TUNEL (méthode de marquage in situ de fragments d'ADN)

Au stade tardif de l'apoptose, un grand nombre de terminaux 3-OH collants sont produits en raison de cassures double brin ou simple brin de l'ADN chromosomique. Sous l'action de la transférase terminale de désoxyribonucléotide (TdT), le dUTP marqué à la luciférase peut se lier au terminal 3 de l'ADN, de sorte que les cellules apoptotiques peuvent être détectées, de telles méthodes sont appelées marquage des extrémités de coupure dUTP médié par la transférase terminale de désoxynucléotidyl (TUNEL). Étant donné que les cellules normales ou en prolifération n'ont presque pas de cassures d'ADN, il n'y a pas de formation de 3-OH et peu peuvent être colorées. TUNEL est en fait une méthode de recherche combinant biologie moléculaire et morphologie. La coloration in situ d'un noyau apoptotique unique complet ou d'un corps apoptotique peut refléter avec précision les caractéristiques biochimiques et morphologiques typiques de l'apoptose. Il peut être utilisé pour déterminer la morphologie cellulaire des sections de tissus incluses dans la paraffine, des sections de tissus congelés, des cellules cultivées et des cellules isolées des tissus, et peut détecter un très petit nombre de cellules apoptotiques. Par conséquent, il est largement utilisé dans l'étude de l'apoptose.

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