Lorsque les cellules subissent une apoptose, elles activent des enzymes endonucléases qui coupent l'ADN génomique entre les nucléosomes. Une échelle d'ADN de 180 à 200 pb a été détectée par électrophorèse après extraction de l'ADN pendant l'apoptose.
Le kit de détection d'apoptose TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 488) peut être utilisé pour détecter la fragmentation de l'ADN nucléaire dans le processus apoptotique tardif des cellules tissulaires. Le principe est que sous l'action de la Terminal Deoxynucleotidyl Transférase (TdT), Alexa Fluor 488-12-DUTP est incorporé dans le terminal 3´-hydroxyl (3´-OH) exposé lors de la rupture de l'ADN génomique. Ainsi, il peut être détecté par microscopie à fluorescence ou par cytométrie de flux.
Le colorant Alexa Fluor 488 est plus stable et possède un signal plus fort, ce qui donne des marqueurs plus brillants et une plus grande résistance à l'extinction.
Ce kit a une large gamme d'applications et peut être utilisé pour détecter l'apoptose dans des coupes congelées ou en paraffine, ainsi que dans des cellules adhérentes ou en suspension cultivées.

Composants du produit

Expédition et stockage

Les composants sont expédiés avec un pack de glace et peuvent être stockés à -20°C pendant 1 année.

Précautions

1. Il est nécessaire de préparer votre propre PBS pour laver les cellules, une solution d'extinction anti-fluorescence pour sceller les comprimés et du paraformaldéhyde à 4 % pour la fixation.

2. À des fins de recherche uniquement !

Instructions

1. La préparation de l'échantillon
1.1 Coupes de tissus incluses dans la paraffine
1.1.1.Les coupes de tissus paraffinés ont été immergées dans du xylène pendant 5 minutes à température ambiante et répétées une fois pour éliminer complètement la paraffine.
1.1.2. Faites tremper les sections dans de l'éthanol à 100 % pendant 5 minutes à température ambiante et répétez une fois.
1.1.3.À température ambiante, les échantillons ont été trempés dans un gradient d’éthanol (90, 80, 70 %) pendant 3 minutes à chaque fois.
1.1.4.Rincez doucement les sections avec du PBS et épongez soigneusement l'excès de liquide autour de l'échantillon sur les lames de verre avec du papier filtre. Dans ce cas, le stylo à paraffine ou le stylo hydrophobe peut être utilisé pour dessiner le contour de la distribution de l'échantillon autour de l'échantillon, ce qui est pratique pour le traitement de la perméabilité en aval et l'opération d'étiquetage de la balance. Ne laissez pas l'échantillon sécher pendant l'expérience. Placez l'échantillon traité dans la boîte humide pour garder l'échantillon humide.
La solution de protéinase K à 1,1,5,2 mg/mL a été diluée avec du PBS dans un rapport de 1:100 pour atteindre une concentration finale de 20 μg/mL.
1.1.6.100 μL de solution de protéinase K à une concentration de 20 μg/mL ont été ajoutés à chaque échantillon pour le recouvrir complètement et incubés à température ambiante pendant 20 min.
[Remarques] : La protéinase K aide les tissus et les cellules à devenir perméables aux réactifs de coloration lors des étapes suivantes. Un temps d'incubation trop long augmentera le risque de chute des sections de tissu de la plaque de support lors des étapes de lavage suivantes, tandis qu'un temps d'incubation trop court peut entraîner un traitement de perméabilité insuffisant et affecter l'efficacité du marquage. Pour obtenir de meilleurs résultats, il peut être nécessaire d'optimiser le temps d'incubation de la protéinase K.
1.1.7.Rincez l'échantillon 2 à 3 fois avec la solution PBS, retirez délicatement l'excès de liquide et épongez soigneusement le liquide autour de l'échantillon sur la lame avec du papier filtre. L'échantillon traité est placé dans une boîte humide pour garder l'échantillon humide.
1.2 Coupe congelée de tissu
1.2.1. Retirer les coupes congelées et les remettre à température ambiante. Les lames ont été immergées dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % (dissoute dans du PBS) puis fixées et incubées pendant 30 min à température ambiante.
1.2.2. Retirez délicatement l'excès de liquide et utilisez du papier filtre pour éponger soigneusement l'excès de liquide autour de l'échantillon sur la lame de verre.
1.2.3. Les lames ont été immergées dans une solution PBS, incubées à température ambiante pendant 15 min, puis lavées à nouveau avec du PBS 2 fois au total.
1.2.4. Retirez délicatement l'excès de liquide et épongez soigneusement la lame de verre avec du papier filtre pour éliminer l'excès de liquide autour de l'échantillon. Dans ce cas, le stylo à paraffine ou le stylo hydrophobe peut être utilisé pour dessiner le contour de la distribution de l'échantillon autour de l'échantillon, ce qui est pratique pour le traitement de la perméabilité en aval et l'opération d'étiquetage de l'équilibre. Pendant l'expérience, ne laissez pas l'échantillon sécher et placez l'échantillon traité dans la boîte humide pour garder l'échantillon humide.
1.2.5. La solution de protéinase K à 2 mg/mL a été diluée avec du PBS dans un rapport de 1:100 pour atteindre une concentration finale de 20 μg/mL.
1.2.6. 100 μL de solution de protéinase K à une concentration de 20 μg/mL ont été ajoutés à chaque échantillon pour le recouvrir complètement et incubés à température ambiante pendant 10 min.
[Remarques] : La protéinase K aide les tissus et les cellules à être perméables aux réactifs de coloration lors des étapes suivantes. Un temps d'incubation trop long augmentera le risque de chute des sections de tissu de la plaque de support lors des étapes de lavage suivantes, tandis qu'un temps d'incubation trop court peut entraîner un traitement de perméabilité insuffisant et affecter l'efficacité du marquage. Il peut être nécessaire d'optimiser le temps d'incubation de la protéinase K si de meilleurs résultats n'ont pas été obtenus.
1.2.7. Rincer l'échantillon 2 à 3 fois dans un bécher ouvert contenant une solution PBS.
[Remarques] : Afin d'éviter la perte d'échantillon lors de l'étape de nettoyage, il est recommandé de ne pas laver le flacon, mais de faire tremper les lames de verre dans une solution PBS 2 à 3 fois pour le nettoyage.
1.2.8. Retirez délicatement l'excès de liquide et utilisez du papier filtre pour éponger soigneusement le liquide autour de l'échantillon sur la lame.L'échantillon traité est placé dans une boîte humide pour préserver l'humidité de l'échantillon.
1.3 Préparation de la feuille d'exploration cellulaire
Les cellules adhérentes ont été cultivées sur des lames Lab-Tek de Chamber. Après le traitement d'induction de l'apoptose, les lames ont été lavées deux fois avec du PBS.
1.4 Préparation de frottis cellulaires (en prenant comme exemple des lames recouvertes de polylysine)
1.4.1. Les cellules ont été remises en suspension dans du PBS à une concentration d'environ 2 × 107 cellules/mL, 50 à 100 μL de la suspension cellulaire ont été aspirés sur des lames recouvertes de polylysine et la suspension cellulaire a été étalée doucement avec une lame propre.
1.4.2. Les cellules ont été fixées et les lames ont été immergées dans une cuve de coloration contenant 4 % de paraformaldéhyde fraîchement préparé dans du PBS et placées à 4 ° C pendant 25 min.
1.4.3. Les lames ont été lavées, immergées dans du PBS et laissées à température ambiante pendant 5 minutes. Laver à nouveau avec du PBS.
1.4.4. Retirez délicatement l'excès de liquide et épongez soigneusement la lame de verre avec du papier filtre pour éliminer l'excès de liquide autour de l'échantillon. Dans ce cas, un stylo à paraffine ou un stylo hydrophobe peut être utilisé pour délimiter la distribution de l'échantillon autour de l'échantillon afin de faciliter le traitement de la perméabilité en aval et les opérations d'étiquetage de la balance. Pendant l'expérience, ne laissez pas l'échantillon sécher et placez l'échantillon traité dans la boîte humide pour garder l'échantillon humide.
1.4.5. La solution de protéinase K à 2 mg/mL a été diluée avec du PBS dans un rapport de 1:100 pour atteindre une concentration finale de 20 μg/mL.
1.4.6. 100 μL de solution de protéinase K à une concentration de 20 μg/mL ont été ajoutés à chaque échantillon pour le recouvrir entièrement et incubés à température ambiante pendant 5 min (ils peuvent également être immergés dans une solution de Triton X-100 à 0,2 % préparée dans du PBS et incubés à température ambiante pendant 5 min pour un traitement de perméabilité).
[Remarques] : La protéinase K aide les tissus et les cellules à être perméables aux réactifs de coloration lors des étapes suivantes. Un temps d'incubation trop long augmentera le risque de chute des sections de tissu de la plaque de support lors des étapes de lavage suivantes, tandis qu'un temps d'incubation trop court peut entraîner un traitement de perméabilité insuffisant et affecter l'efficacité du marquage. Il peut être nécessaire d'optimiser le temps d'incubation de la protéinase K si de meilleurs résultats n'ont pas été obtenus.
1.4.7. Rincez l'échantillon 2 à 3 fois avec du PBS, retirez délicatement l'excès de liquide et épongez soigneusement le liquide autour de l'échantillon sur la lame avec du papier filtre. Les échantillons traités ont été placés dans une boîte humide.
2. Étapes du traitement à la DNase des témoins positifs
Après la perméation de l’échantillon, les cellules ont été traitées avec de la DNase I pour préparer des lames de contrôle positif. Ce processus provoque généralement la plupart des cellules traité pour montrer une fluorescence verte.
[Notes] : Le traitement à la DNase I des cellules immobilisées provoque la rupture de l'ADN chromosomique, produisant de nombreuses extrémités 3' d'ADN qui peuvent être marquées.
2.1. Diluer 10 × tampon DNase I avec de l'eau déionisée dans un rapport de 1:10 (200 µL de tampon DNase I 1× sont nécessaires pour chaque échantillon, c'est-à-dire que 20 µL de tampon DNase I 10 × et 180 µL d'eau déionisée sont nécessaires pour la dilution). Une goutte de 100 µl a été ajoutée à l'échantillon perméable et incubée pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 1 µL de DNase I (1U/µL) aux 100 µL restants de tampon DNase I 1 × pour obtenir une concentration finale de 10 U/mL.
2.2. Le liquide a été doucement retiré, puis 100 μL de tampon contenant 10 U/mL de DNase I ont été ajoutés et incubés pendant 10 min à température ambiante.
2.3. Tapez sur la lame pour éliminer l'excès de liquide et lavez soigneusement la lame 3 à 4 fois dans un réservoir de colorant avec de l'eau déionisée.
[Remarques] : Un réservoir de coloration séparé doit être utilisé pour les lames de contrôle positif, sinon la DNase I résiduelle sur les lames de contrôle positif peut introduire un bruit de fond élevé sur les lames expérimentales.
3. Étiquetage et détection
3.1.Le tampon d'équilibrage (5 × tampon d'équilibrage) est dilué avec de l'eau déionisée dans un rapport de 1:5 (100 μL de 1 × tampon d'équilibrage sont nécessaires pour chaque échantillon).
3.2. Un tampon d'équilibrage (100 μl de tampon d'équilibrage 1×) a été ajouté à chaque échantillon pour équilibrer complètement la zone et incubé pendant 10 à 30 min à température ambiante. Vous pouvez également placer les lames dans une cuve de décongélation avec un tampon d'équilibrage 1 x pour vous assurer que les lames sont équilibrées. Décongelez le mélange de marquage Alexa Fluor 488-12-DUTP sur de la glace tout en équilibrant les cellules et préparez suffisamment de tampon d'incubation TdT pour toutes les expériences et les réactions de contrôle positif facultatives conformément au tableau 1. Pour une réaction standard avec une surface inférieure à 5 cm2, le volume est de 50 μl et 50 μl sont multipliés par le nombre de réactions expérimentales et de contrôle positif pour déterminer le volume total de tampon d'incubation TdT requis. Pour les échantillons avec des surfaces plus grandes, le volume du réactif peut être augmenté proportionnellement.

Tableau 1 Tampons d'incubation TdT préparés pour les expériences et réactions de contrôle positif facultatives

[Système de contrôle négatif] : Un tampon d’incubation témoin sans enzyme TdT a été préparé et l’enzyme TdT a été remplacée par ddH2O.
3.3. La majeure partie des 100 μl de tampon d'équilibrage 1× a été lavée avec du papier absorbant autour de la zone équilibrée, puis 50 μl de tampon d'incubation TdT ont été ajoutés à une zone de cellules de 5 cm2. Ne laissez pas les cellules sécher. Après cela, la lame doit être protégée de la lumière.
3.4. Placez une lamelle en plastique sur les cellules pour assurer une répartition uniforme des réactifs et placez une serviette en papier imbibée d'eau au fond de la boîte humide. Les lames ont été placées dans une boîte humide et incubées à 37 ℃ pendant 60 min. Enveloppez la boîte humide dans du papier aluminium pour la protéger de la lumière.
[Remarques] : Le verre de protection en plastique peut être coupé en deux avant utilisation. Repliez le bord du verre de protection pour un retrait et une manipulation faciles.
3.5. Les lamelles en plastique ont été retirées et les coupes ont été incubées dans une solution PBS à température ambiante pendant 5 minutes. Les coupes ont ensuite été lavées deux fois avec du PBS frais.
3.6. Essuyez délicatement la solution PBS autour et au dos de l'échantillon avec du papier filtre.
[Remarques] : Afin de réduire le bruit de fond, après avoir lavé les lames avec du PBS une fois, elles peuvent être lavées avec du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 et 5 mg/mL de BSA 3 fois, 5 min à chaque fois, afin que les marqueurs libres n'ayant pas réagi soient clairs et propres.
3.7. Les échantillons ont été colorés dans une cuve de coloration et les lames ont été immergées dans une cuve de coloration contenant une solution de PI (1 μg/mL, fraîchement préparée et diluée avec du PBS) dans l'obscurité et laissées à température ambiante pendant 5 min. (Facultatif) : Les échantillons ont été colorés dans une cuve de coloration et les lames ont été immergées dans une cuve de coloration contenant une solution de DAPI (2 μg/mL, fraîchement préparée et diluée avec du PBS) dans l'obscurité et laissées à température ambiante pendant 5 min.
3.8.Laver l'échantillon, immerger la lame dans de l'eau déionisée et la laisser à température ambiante pendant 5 minutes. Répéter deux fois pour un total de trois lavages.
3.9. L'excès d'eau sur la lame a été éliminé et 100 μl de PBS ont été ajoutés à la zone d'échantillon pour garder l'échantillon humide.
3.10. Les échantillons ont été immédiatement analysés au microscope à fluorescence et la fluorescence verte a été observée à 520±20 nm avec un dispositif de filtrage de fluorescence standard. La fluorescence rouge du PI a été observée à > 620 nm, ou la fluorescence bleue du DAPI a été observée à 460 nm. Si nécessaire, les lames peuvent être conservées toute la nuit à 4°C dans l'obscurité.
[Remarques] : Le PI/DAPI pouvait colorer les cellules apoptotiques et non apoptotiques en rouge/bleu, et c'est seulement dans les noyaux apoptotiques que l'Alexa Fluor 488-12-DUTP était incorporé et que la fluorescence verte était localisée.
4. Les cellules en suspension ont été détectées par cytométrie de flux
4.1. 3~5 × 106 cellules ont été lavées deux fois avec du PBS par centrifugation (300 × g) à 4 ° C, centrifugées à 300 g à 4 ° C pendant 10 min, puis remises en suspension dans 0,5 mL de PBS.
4.2. Les cellules ont été fixées et 5 ml d'une solution de paraformaldéhyde à 1 % préparée dans du PBS ont été ajoutés et placés sur de la glace pendant 20 min.
4.3. Les cellules ont été centrifugées à 300 × g à 4 °C pendant 10 min, et le surnageant a été retiré et remis en suspension dans 5 ml de PBS. Le lavage a été répété une fois et les cellules ont été remises en suspension dans 0,5 ml de PBS.
4.4. Les cellules ont été perméables et 5 ml d'éthanol à 70 % pré-refroidi par de la glace ont été ajoutés et incubés à -20 °C pendant 4 heures. Les cellules peuvent être stockées dans de l'éthanol à 70 % à -20 ℃ pendant une semaine, ou les cellules peuvent être perméables avec une solution de Triton X-100 à 0,2 % préparée dans du PBS et stockées à température ambiante pendant 5 minutes.
4.5. Les cellules ont été centrifugées à 300 × g pendant 10 min et remises en suspension dans 5 ml de PBS. La centrifugation a été répétée et remise en suspension dans 1 ml de PBS.
4.6. Transférer 2 × 106 cellules dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.
4.7. L'équilibre a été centrifugé à 300×g pendant 10 min, et le surnageant a été retiré et remis en suspension avec 80 μL de tampon d'équilibrage 1×. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
4.8. Lors de l'équilibrage des cellules, le mélange de marquage Alexa Fluor 488-12-DUTP a été fondu sur de la glace et une quantité suffisante de tampon d'incubation TdT pour toutes les réactions a été préparée conformément au tableau 1. Pour une réaction standard de 2 × 106 cellules, le volume est de 50 μL et 50 μL multiplié par le nombre de réactions est le volume total de tampon d'incubation TdT requis.
4.9. Les cellules ont été centrifugées à 300×g pendant 10 min, le surnageant a été retiré et le précipité a été remis en suspension dans 50 μl de tampon d'incubation TdT et incubé à 37℃ pendant 60 min, à l'abri de la lumière. Les cellules ont été doucement remises en suspension toutes les 15 min à l'aide d'une micropipette.
4.10. La réaction a été interrompue en ajoutant 1 ml d'EDTA 20 mM et en mélangeant doucement avec une micropipette.
4.11. Après centrifugation à 300 g pendant 10 min, le surnageant a été éliminé et le précipité a été remis en suspension dans 1 ml de solution à 0,1 % de Triton X-100 préparée dans du PBS, contenant 5 mg/ml de BSA. La solution a été répétée une fois et lavée deux fois au total.
4.12. Le surnageant a été éliminé par centrifugation à 300 g pendant 10 min, et les cellules ont été remises en suspension dans 0,5 ml de solution à 5 μg/mlPI nouvellement préparée avec du PBS, qui contenait 250 μg de RNase A sans DNase.
4.13. Les cellules ont été incubées dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante.
4.14. Les cellules ont été analysées par cytométrie de flux et la fluorescence verte a été observée à 520±20 nm. La fluorescence rouge de PI a été observée à > 620 nm. PI pouvait colorer en rouge les cellules apoptotiques et non apoptotiques et c'est seulement dans les noyaux apoptotiques que l'Alexa Fluor 488-12-DUTP était incorporé et que la fluorescence verte était localisée.