Le kit de détection de l'apoptose cellulaire Annexin V-EGFP/PI utilise l'Annexin V marquée à l'EGFP comme sonde pour détecter l'apparition d'une apoptose cellulaire précoce.
Le principe de détection est le suivant : dans les cellules vivantes normales, la phosphotidylsérine (PS) est située sur la face interne de la membrane cellulaire, mais dans les cellules apoptotiques précoces, la PS bascule de la face interne de la membrane cellulaire vers la surface de la membrane cellulaire et est exposée à l'environnement extracellulaire. L'annexine-V est une Ca²⁺ -protéine de liaison aux phospholipides dépendante de la protéine, d'un poids moléculaire de 35 à 36 kDa, qui se lie au PS avec une forte affinité. La phosphatidylsérine peut se lier à la membrane des cellules apoptotiques précoces par l'intermédiaire de la phosphatidylsérine exposée à l'extérieur de la cellule.
De plus, l'iodure de propidium (IP) est utilisé pour distinguer les cellules précoces survivantes des cellules nécrotiques ou apoptotiques tardives. L'IP est un colorant d'acide nucléique qui ne peut pas traverser la membrane cellulaire intacte des cellules normales ou des cellules apoptotiques précoces, mais peut traverser la membrane cellulaire des cellules apoptotiques tardives et nécrotiques et rendre le noyau rouge. Ainsi, lorsque l'annexine V a été combinée à l'IP, l'IP a été exclu des cellules vivantes (annexine V^-/PI^-) et les cellules apoptotiques précoces (Annexine V⁺/PI^-). Les cellules apoptotiques tardives et nécrotiques étaient doublement positives pour l'EGFP et le PI (Annexine V⁺/PI⁺).
Ce kit est adapté à la cytométrie de flux et à la microscopie à fluorescence.

Composants du produit

Expédition et stockage

Les composants sont expédiés avec un pack de glace et peuvent être conservés à -20°C à l'abri de la lumière et éviter les congélations et décongélations répétées pendant 1 an.
[Remarques] : S'il doit être utilisé à plusieurs reprises sur une courte période, il peut être conservé à 4 ℃ et protégé de la lumière pendant six mois.

Précautions

1) L’apoptose étant un processus rapide, il est recommandé d’analyser les échantillons dans l’heure suivant la coloration.
2) Pour les cellules adhérentes, la digestion est une étape critique. N'utilisez pas d'EDTA dans la solution digestive car l'EDTA peut affecter la liaison de l'annexine V au PS.
3) L'annexine V-FITC, mais pas l'annexine V-EGFP, doit être utilisée pour fixer les cellules, par exemple pour détecter l'apoptose et le cycle cellulaire en même temps, car l'EGFP serait dénaturé et perdrait sa capacité à exciter la fluorescence pendant la fixation. Les cellules ont été incubées avec l'annexine V-FITC avant la fixation et l'annexine V-FITC non liée a été éliminée par lavage avec un tampon de liaison.Parce que l’augmentation de la perméabilité cellulaire pendant la fixation crée des débris cellulaires qui peuvent se lier à l’annexine V et interférer avec les résultats.
4) Si l'échantillon provient du sang, veillez à retirer les plaquettes du sang. En effet, les plaquettes contiennent du PS, qui peut se lier à l'annexine V, ce qui interfère avec les résultats. Les plaquettes peuvent être éliminées par lavage à l'aide d'un agent tampon contenant de l'EDTA et d'une centrifugation à 200 g.
5) Veuillez centrifuger brièvement le réactif avant d'ouvrir le couvercle et jeter le liquide sur la paroi intérieure du couvercle au fond du tube pour éviter les éclaboussures de liquide lors de l'ouverture du couvercle.
6) L'annexine V-EGFP et le PI sont des substances photosensibles, veuillez donc éviter la lumière pendant le fonctionnement.
7) À usage de recherche uniquement !

Instructions

Conception de l'expérience
Tube vide : des cellules témoins négatives sans annexine V-EGFP et solution de coloration PI ont été utilisées pour la régulation de la tension.
Tubes colorés simples : des cellules témoins positives, supplémentées uniquement avec de l'annexine V-EGFP, ont été utilisées pour moduler la compensation.
Tube de détection : les cellules ont été traitées avec de l'annexine V-EGFP et une solution de coloration PI. Les données expérimentales ont été obtenues en ajustant les paramètres du tube vierge et du tube à colorant unique.
1.1 Teinture d'échantillons
1) cellule de suspension : Les cellules ont été collectées par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4°C.
cellule adhérente : Après digestion à la trypsine sans EDTA, les cellules ont été récoltées par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4°C. Le temps de digestion à la trypsine ne doit pas être trop long pour éviter les faux positifs.
2) Les cellules ont été lavées avec du PBS prérefroidi deux fois, chaque fois à 300 g, et centrifugées à 4 ℃ pendant 5 min.
3) Les cellules ont été remises en suspension avec 1×tampon de liaison et la concentration a été ajustée à 1~5 ×106/mL.
4) 100 μL de suspension cellulaire ont été ajoutés dans des tubes de cytométrie de flux de 5 mL, 5 μl d'annexine V-EGFP ont été ajoutés et les cellules ont été mélangées et incubées pendant 5 min à température ambiante sous la lumière.
5) En ajoutant 10 μl de solution PI et 400 μl de PBS, la coloration a été réalisée immédiatement.
[Remarques] : Lors de l'utilisation de la cytométrie de flux pour détecter l'apoptose, l'IP est grandement affecté par le temps, et un temps trop long entraînera une augmentation de la coloration de l'IP, la cytométrie de flux doit donc être effectuée dans un délai d'une heure.
1.2 Analyse par cytométrie de flux
Français La longueur d'onde d'excitation maximale de l'EGFP était de 488 nm et la longueur d'onde d'émission maximale était de 507 nm ; la longueur d'onde d'excitation maximale du complexe PI-ADN était de 535 nm et la longueur d'onde d'émission maximale était de 615 nm. Un logiciel tel que CellQuest a été utilisé pour l'analyse et un graphique à points bicolore a été dessiné, EGFP étant l'abscisse et PI l'ordonnée. Collectez 10 000 événements par échantillon. Dans une expérience typique, les cellules peuvent être divisées en trois sous-groupes, les cellules vivantes n'ayant qu'une fluorescence de fond de très faible intensité, les cellules apoptotiques précoces n'ayant qu'une forte fluorescence verte et les cellules apoptotiques tardives ayant une double coloration de fluorescence verte et rouge.