Le principe de détection du kit de détection d'apoptose Annexin V-Alexa Fluor488/PI est le suivant : dans les cellules vivantes normales, la phosphotidylsérine (PS) est située sur la face interne de la membrane cellulaire, mais dans les cellules apoptotiques précoces, la PS bascule de la face interne de la membrane cellulaire vers la surface de la membrane cellulaire et est exposée à l'environnement extracellulaire. L'annexine-V est un Ca²⁺ -protéine de liaison aux phospholipides dépendante de la protéine avec un poids moléculaire de 35 à 36 KD, qui se lie avec une forte affinité au PS et se lie à la membrane cellulaire des cellules apoptotiques précoces par l'intermédiaire de la phosphatidylsérine exposée à l'extérieur de la cellule.
De plus, l'iodure de propidium (IP) est utilisé pour distinguer les cellules précoces survivantes des cellules nécrotiques ou apoptotiques tardives. L'IP est un colorant d'acide nucléique qui ne peut pas traverser la membrane cellulaire intacte des cellules normales ou des cellules apoptotiques précoces, mais peut traverser la membrane cellulaire des cellules apoptotiques tardives et nécrotiques et rendre le noyau rouge. Ainsi, lorsque l'annexine V a été combinée à l'IP, l'IP a été exclu des cellules vivantes (annexine V^-/PI^-) et les cellules apoptotiques précoces (Annexine V⁺/PI^-). En revanche, les cellules apoptotiques tardives et nécrotiques étaient doublement positives pour Alexa Fluor488 et PI (Annexine V⁺/PI⁺).

Composants du produit

Expédition et stockage

Les composants sont expédiés avec un pack de glace et peuvent être stockés à -20°C pendant 1 an.

Précautions

1) L’apoptose étant un processus rapide, il est recommandé d’analyser les échantillons dans l’heure suivant la coloration.
2) Pour les cellules adhérentes, la digestion est une étape critique. N'utilisez pas d'EDTA dans la solution digestive car l'EDTA peut affecter la liaison de l'annexine V au PS.
3) Si l'échantillon provient du sang, veillez à éliminer les plaquettes du sang. En effet, les plaquettes contiennent du PS, qui peut se lier à l'annexine V, ce qui interfère avec les résultats. Un agent tampon contenant de l'EDTA peut être utilisé et les plaquettes éliminées par centrifugation à 200 g.
4) Veuillez centrifuger brièvement le réactif avant d'ouvrir le couvercle et jeter le liquide sur la paroi intérieure du couvercle au fond du tube pour éviter les éclaboussures de liquide lors de l'ouverture du couvercle.
5) L'Annexine V-Alexa Fluor488 et le PI sont des substances photosensibles et doivent être conservés à l'abri de la lumière lors de leur manipulation.
6) À usage de recherche uniquement !

Instructions

1.1 échantillon de teinture
1.a) cellule suspendue : Les cellules ont été collectées par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4°C.
b) cellules adhérentes : après digestion à la trypsine sans EDTA, les cellules ont été récoltées par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 °C. Le temps de digestion à la trypsine ne doit pas être trop long pour éviter les faux positifs.
2. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS prérefroidi à 4 °C, chaque fois en utilisant 300 g, et centrifugées à 4 °C pendant 5 min.
3. Les cellules ont été remises en suspension en ajoutant 250 μL de tampon de liaison 1×, et la concentration a été ajustée à 1×106/mL.
4. 100 μL de suspension cellulaire ont été ajoutés dans un tube de cytométrie de flux de 5 ml, 5 μL d'Annexine V-Alexa Fluor 488 et 10 μL de PI ont été ajoutés et mélangés doucement.
5. La réaction a été conservée à l’abri de la lumière et à température ambiante pendant 15 minutes.
6. 400 μL de tampon de liaison 1× ont été ajoutés, mélangés et les échantillons ont été détectés par cytométrie de flux dans un délai d'une heure.
[Remarques] : Pour éviter la perte de cellules pendant le lavage des cellules, une petite pointe peut être utilisée pour aspirer le liquide.
1.2 Analyse par cytométrie de flux
Alexa Fluor488 a une longueur d'onde d'excitation maximale de 488 nm et une longueur d'onde d'émission maximale de 519 nm. La longueur d'onde d'excitation maximale du complexe PI-ADN était de 535 nm et la longueur d'onde d'émission maximale était de 615 nm. CellQuest et d'autres logiciels ont été utilisés pour analyser et dessiner un graphique à points bicolore avec Alexa Fluor488 comme abscisse et PI comme ordonnée. Collectez 10 000 événements par échantillon.
1.3 Analyse par microscopie à fluorescence
1) Déposez une goutte de suspension cellulaire doublement colorée avec l'Annexine V-FITC/PI sur la lame et recouvrez les cellules avec une lamelle.
2) Il a été observé au microscope à fluorescence avec un filtre bicolore. Le signal de fluorescence de l'annexine V-FITC était vert et le signal de fluorescence de la PI était rouge.