1. Que sont les cellules dendritiques (CD) ?
Les cellules dendritiques (DC) sont les cellules présentatrices d'antigènes (APC) les plus efficaces du corps humain. Les DC sont les seules APC capables de stimuler de manière robuste la prolifération des lymphocytes T naïfs. Les autres types d'APC (tels que les monocytes, les macrophages, les lymphocytes B, etc.) ne peuvent stimuler que les lymphocytes T activés ou mémoires. Par conséquent, les cellules DC sont les initiateurs des réponses immunitaires adaptatives des lymphocytes T et jouent un rôle extrêmement important dans l'immunité tumorale. Les cellules DC expriment fortement les molécules MHC-I et MHC-II à leur surface et possèdent des marqueurs de surface spécifiques. Elles absorbent, traitent et stimulent les lymphocytes T pour activer les antigènes et déterminent finalement la direction de différenciation des lymphocytes T.
2. Source de courant continu
Les cellules DC sont présentes en très petites quantités dans l'organisme. Il faut beaucoup de temps pour isoler directement les DC de l'organisme et le rendement cellulaire est très faible, ce qui limite considérablement la recherche et l'application des DC. Cependant, les DC peuvent être différenciées et induites à partir de cellules précurseurs de DC dans différents tissus, tels que les cellules précurseurs du liquide de moelle osseuse, les monocytes du sang périphérique et du sang du cordon ombilical.
Chez l'homme, le sang périphérique humain étant le plus facile à obtenir et contenant le plus grand nombre de monocytes, la méthode la plus couramment utilisée consiste à induire des DC à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC). Chez la souris, la méthode la plus courante consiste à induire des DC à partir de cellules de la moelle osseuse, à savoir des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC).
Figure 1. Schéma de principe de la méthode classique de préparation du BMDC
3. Méthode de préparation du BMDC
Les méthodes courantes de préparation des BMDC de souris sont :
3.1 Méthode de culture BMDC classique - Méthode Inaba (modifiée)
3.2 Préparation à grande échelle de BMDC - Méthode Sons
3.3 Préparation à grande échelle de BMDC - méthode Lutz
3.1 [Méthode de culture BMDC classique] - Méthode Inaba (améliorée)
【Arrière-plan】
un. Le nombre de BMDC obtenus par la méthode Inaba est de 5 à 7 x 106/souris;
b. La méthode originale d'Inaba utilise uniquement le GM-CSF pour induire la production de BMDC. Bien que les BMDC obtenus aient une forte capacité de stimulation dans la réaction lymphocytaire mixte, la maturité des DC n'est pas aussi bonne que celle de l'induction combinée de GM-CSF+IL-4. Par conséquent, la méthode améliorée ultérieure utilise souvent l'induction combinée de GM-CSF+IL-4.
【Étapes de culture】
3.1.1 Obtention de cellules de moelle osseuse de souris
1) Les souris (âgées de 6 à 10 semaines) ont été tuées par luxation cervicale, tous les fémurs et tibias ont été retirés chirurgicalement et le tissu musculaire autour des os a été retiré autant que possible avec des ciseaux et des pinces.
[Note] Ne pas endommager les os.
2) Déplacez l'os sur le banc propre et faites-le tremper dans une boîte de culture stérile contenant 70 % d'alcool pendant 2 à 5 minutes pour le désinfecter et le stériliser, puis lavez-le deux fois avec du PBS stérile.
3) Déplacez l'os dans une autre boîte de culture contenant du PBS, coupez les deux extrémités de l'os avec des ciseaux, puis utilisez une seringue pour extraire le PBS. Insérez l'aiguille dans la cavité de la moelle osseuse par les deux extrémités de l'os et rincez à plusieurs reprises la moelle osseuse dans la boîte de culture jusqu'à ce que l'os devienne complètement blanc.
4) Recueillir la suspension de moelle osseuse et filtrer les petits fragments et le tissu musculaire avec une maille en nylon de 200 mesh.
5) Centrifuger le filtrat à 1200 tr/min pour 5 minutes et jeter le surnageant.
6) Ajouter 2 ml de tampon de lyse des globules rouges au chlorure d'ammonium (1x), remettre les cellules en suspension et incuber à température ambiante pendant 3 à 5 minutes.5 minutes, jusqu'à 10 min.
7) Ajouter 10 ml de PBS pour neutraliser l'effet du tampon de lyse, puis centrifuger à 1200 tr/min pendant 5 minutes et jeter le surnageant.
8) Laver une fois avec du PBS, puis remettre les cellules en suspension dans du milieu de culture RPMI1640 contenant 10 % de FBS. Des cellules de moelle osseuse de souris ont été obtenues.
Préparation de la solution de lyse des globules rouges au chlorure d'ammonium :
un. Préparez une solution de stockage 10x comme suit : pesez 82,9 g NH4Cl, 10,0 g de KHCO3 et 0,37 g de Na2EDTA, dissoudre dans 1 L d'eau distillée, filtrer avec 0,22 membrane filtrante μm à stériliser et conserver à 4℃ pendant 6 mois ;
b. Avant utilisation, diluer la solution de stockage 10x avec de l'eau distillée stérile 1:9 jusqu'à 1x solution de travail.
[Note] Étant donné que la solution de lyse des globules rouges au chlorure d'ammonium a un certain effet nocif sur les cellules de la moelle osseuse, le temps d'hémolyse doit être raccourci autant que possible.
3.1.2 Induction de la différenciation des BMDC
1) Comptez les cellules de moelle osseuse de souris obtenues à l'étape 1 et ajustez la concentration cellulaire à 0,5-1× 106/ml avec milieu de culture complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS.
2) Plaque dans une plaque de culture à 24 puits, 1 ml de cellules par puits, ajouter du GM-CSF de souris recombinant (20 ng/mL) et l'IL-4 (10 ng/mL), et culture à 37℃, 5% CO2 incubateur. C'est le 0ème jour de culture.
【Note】
un. Généralement, environ 4-5x107 les cellules de moelle osseuse peuvent être récoltées à partir d'une souris, de sorte qu'au moins 40 à 50 puits d'une plaque à 24 puits peuvent être plaqués.
b. Les concentrations de GM-CSF et d'IL-4 sont comprises entre 20 et 50 ng/mL et 10-40 ng/mL, respectivement.
3) Agiter doucement la plaque de culture tous les 2 jours, puis remplacer les 3/4 du volume par du milieu de culture frais et reconstituer les cytokines.
4) Entre le 5e et le 8e jour, soufflez doucement le milieu de culture pour recueillir les cellules en suspension et les cellules faiblement attachées.
5) Centrifugeuse à 1200 tr/min pour 5 minutes et jeter le surnageant.
6) Remettre les cellules en suspension dans du milieu de culture complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et les compter, puis ajuster la concentration cellulaire à 1 × 106/ml, et ajouter du GM-CSF de souris recombinant (20 ng/mL) et IL-4 (10 ng/mL).
7 ) Placer les cellules dans des boîtes de culture de 100 mm (jusqu'à 10 ml par boîte) ou dans des plaques de culture à 6 puits (2 m/puits).
8) Poursuivre la culture à 37℃, 5% CO2 incubateur pendant 1 à 2 jours.
9) Recueillir les cellules en suspension, qui sont les BMDC les plus matures.
【Note】
un. Les étapes 2.5 à 2.8 sont des étapes de re-placage dont le but est de rendre le BMDC obtenu à l'étape 2.4 plus mature.
b. Dans les 3 heures suivant le re-placage, de nombreuses cellules adhérentes épineuses peuvent être observées en train de migrer à partir des amas de DC, et après 1 jour de culture, ces cellules adhérentes se détachent du fond de la plaque de culture, et de nombreuses DC typiques peuvent être observées flottant dans le milieu de culture.
3.1.3 Maturation complète du BMDC
[Remarque] Les BMDC obtenues à l'étape 2 ne sont pas des DC complètement matures. Si vous souhaitez obtenir des DC complètement matures, vous devez toujours être induit par LPS, CD40L ou TNF-a.
1) Centrifuger le BMDC obtenu à l'étape 2.4 ou 2.9 à 1200 tr/min pour 5 minutes et jeter le surnageant.
2) Remettre en suspension le précipité avec du milieu de culture complet RPMI contenant du GM-CSF de souris recombinant (20 ng/mL) et l'IL-4 (10 ng/mL), et ajustez la concentration cellulaire à 1×106/ml après comptage.
3) Ajouter aux plaques de culture à 24 puits et ajouter des inducteurs de maturation tels que le TNF-α (250 U/mL), LPS (1 μg/mL) ou CD40L (1 (µg/mL).
4) Culture à 37℃, 5% CO2 incubateur pendant 2 jours.
5) Collectez les cellules en suspension et les cellules qui se développent faiblement attachées à la paroi, qui sont des cellules dendritiques matures.
3.2【Méthode de production de masse BMDC】- Méthode fils
【Arrière-plan】
un. Cette méthode peut obtenir 30-40×106 DC/souris en 7 jours, soit 7 à 10 fois plus que la méthode classique d'Inaba. Après centrifugation des DC à travers un gradient de métrizamide à 14,5 %, la pureté (c'est-à-dire les cellules CD11c+/I-Ab+) peut atteindre 85 à 95 %.
b. La capacité d'endocytose des DC obtenue par cette méthode est plus faible que celle de la méthode classique d'Inaba, mais la quantité d'IL-12p70 sécrétée est similaire.
c. Le DC obtenu par cette méthode a une capacité de stimulation dans la réaction lymphocytaire mixte plus forte que la méthode classique d'Inaba.
d. Les DC obtenus par cette méthode peuvent induire une réponse spécifique des cellules T plus forte.
f. En résumé, la méthode Son permet d'obtenir des BMDC de plus en plus matures que la méthode classique.
【Étapes de culture】
3.2.1 Obtention de cellules de moelle osseuse de souris
Voir les étapes correspondantes dans la méthode Inaba (modifiée).
3.2.2 Préparation de grandes quantités de BMDC
1) Comptez les cellules de moelle osseuse de souris obtenues à l'étape 1 et ajustez la concentration cellulaire à 2×105/ml avec milieu de culture complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS.
2) Répartir dans des plaques de culture à 6 puits, 5 ml de cellules par puits, ajouter du GM-CSF de souris recombinant (1000 U/mL) et IL-4 (1000 U/mL), et culture à 37℃, 5% CO2 incubateur.
3) Au 4e jour de culture, compléter le système de culture avec du GM-CSF de souris recombinant (1000 U/mL) et IL-4 (1000 U/mL).
4) Recueillir les DC le 7e jour de culture, les remettre en suspension avec 2 à 4 ml de milieu de culture complet RPMI 1640, ajouter à un volume égal de 14,5 % (p/v) de mépanema et centrifuger à température ambiante pendant 20 minimum à 1200xg.
5) Récupérez la couche intermédiaire et lavez-la trois fois avec du milieu de culture complet RPMI 1640 pour une utilisation ultérieure.
[Note] À ce stade, le DC est un BMDC immature. Si vous souhaitez le faire mûrir davantage, passez à l'étape 3.
3.2.3 Maturité complète du BMDC
1) Les BMDC collectés à l'étape 2.4 ont été replaqués et du GM-CSF de souris recombinant a été ajouté (1000 U/mL) et IL-4 (1000 U/mL), ainsi que LPS (1-10 μg/mL) au système de culture
2) Cultivé à 37℃, 5% CO2 incubateur pendant 2 jours pour obtenir des BMDC matures.
3.3【Méthode de préparation de masse BMDC】-Méthode Lutz
【Arrière-plan】
un. La méthode Lutz est similaire à la méthode Son, et les deux méthodes peuvent préparer du BMDC en grande quantité, mais la méthode Lutz est plus largement utilisée que la méthode Son.
b. Cette méthode peut obtenir plus de BMDC, jusqu'à 1-3 x 108 DC/souris, et la pureté peut atteindre 90-95 % ;
c. La concentration de cytokines utilisée dans cette méthode est bien inférieure à celle de la méthode Son, seulement 200 U/mL, et il tombe à 30-100 U/mL du 8ème au 10ème jour de culture, ce qui peut permettre de réduire considérablement le coût des réactifs ;
d. La principale différence entre cette méthode et la méthode classique d'Inaba et la méthode de Son est que les cellules de moelle osseuse sont cultivées dans une boîte de Petri au lieu d'une plaque de culture cellulaire. Inaba a expliqué que la boîte de Petri ne permet pas aux macrophages de la moelle osseuse d'adhérer facilement à la paroi, ce qui inhibe le développement des macrophages et évite l'effet inhibiteur des macrophages sur la maturation des cellules dendritiques. C'est peut-être la principale raison pour laquelle cette méthode permet d'obtenir un grand nombre de cellules dendritiques BMDC à une densité de placage plus faible.
f. Cependant, le temps de culture de cette méthode est relativement long, nécessitant 10 à 12 jours. D'une part, cela permet d'obtenir plus de BMDC. D'autre part, la plupart des granulocytes et des lymphocytes ont du mal à survivre aussi longtemps, ce qui permet d'améliorer la pureté des BMDC finalement obtenues ;
f. Cette méthode utilise uniquement le GM-CSF pour la culture d'induction et les BMDC obtenues contiennent à la fois des DC immatures et matures. Pour améliorer encore la maturité, il faut utiliser du LPS ou du TNF-α pendant 1 à 2 jours supplémentaires d'induction et la teneur en cellules DC matures atteindra 50 à 70 %.
【Étapes de culture】
3.3.1 Obtention de cellules de moelle osseuse de souris
Voir les étapes correspondantes dans la méthode Inaba (modifiée) et notez que l’étape d’hémolyse doit être omise.
3.3.2 Préparation à grande échelle du BMDC
1) Comptez les cellules de moelle osseuse de souris obtenues à l'étape 1 et ajustez la concentration cellulaire à 2×105/ml avec milieu de culture complet RPMI 1640 contenant 10 % de FBS ;
2) Répartir dans des boîtes de culture bactérienne de 100 mm (boîte de Petri), 10 ml de cellules par boîte, et ajouter du GM-CSF de souris recombinant (200 U/mL), et culture à 37℃, incubateur à 5% de CO2 ;
[Note] Ici, on utilise des boîtes de culture bactérienne et non des plaques de culture cellulaire.
3) Le 3ème jour, ajouter 10 ml de milieu de culture complet contenant 20 ng/mL GM-CSF de souris recombinant dans la boîte de culture ;
4) Les 6e et 8e jours, changer la moitié du milieu, c'est-à-dire récupérer l'ancien milieu de culture, remettre le culot cellulaire en suspension avec du milieu de culture complet contenant 20 ng/mL GM-CSF de souris recombinant après centrifugation, puis remettre la suspension cellulaire dans la boîte d'origine ;
5) Le 10e jour, les cellules peuvent être collectées, qui sont des BMDC.
3.3.3 Maturation complète des BMDC
1) Recueillir les cellules en suspension en soufflant doucement les DC le 10e jour de culture avec une pipette et centrifuger à 300xg pendant 5 minutes à température ambiante ;
2) Jeter le surnageant, remettre le culot cellulaire en suspension avec 10 ml de milieu de culture complet RPMI 1640, puis l'étaler sur une plaque de culture cellulaire de 100 mm ;
3) Ajouter du GM-CSF de souris recombinant (100 U/mL) et TNF-α (500 U/mL), ou GM-CSF de souris recombinant (100 U/mL) et LPS (1 (µg/mL);
4) Poursuivre la culture à 37℃, 5% CO2 incubateur pendant 1 à 2 jours.
4. Identification des BMDC
l Observation morphologique : la plupart des BMDC se développent en colonies et les cellules présentent de multiples protubérances dendritiques, qui sont plus évidentes dans les BMDC matures.
l Analyse du phénotype cellulaire : La cytométrie de flux a été utilisée pour détecter l'expression des molécules CD11c, CD40, CD80, CD86 et MHC de classe II (IA/IE) à la surface des cellules DC. Les cellules DC BMDC expriment fortement ces molécules et l'expression de ces molécules dans les cellules DC BMDC complètement matures sera encore augmentée.
l Réaction lymphocytaire mixte (MLR) : les BMDC ont une forte capacité de stimulation, et plus la maturité est élevée, plus la capacité de stimulation est forte.
5. Comment choisir un inducteur de maturation ?
Le LPS, le CD40L et le TNF-α sont des inducteurs de maturation couramment utilisés et efficaces pour les cellules dendritiques humaines et les cellules dendritiques murines. Le TNF-α a la plus faible capacité à induire la maturation des cellules dendritiques parmi les trois. Le LPS et le CD40L sont tous deux de puissants inducteurs de la maturation complète des cellules dendritiques in vitro. La maturation des cellules dendritiques induite par les deux est similaire, mais le spectre des cytokines induites est différent. Les cellules dendritiques matures induites par le CD40L présentent la plus forte capacité immunorégulatrice in vivo, y compris la génération de réponses immunitaires tumorales protectrices et thérapeutiques. La concentration utilisée pour stimuler la maturation complète des cellules dendritiques avec le LPS est généralement de 1 à 10 μg/mL, mais en fait 0,1 μg/mL a un effet très fort, mais à des fins d'assurance, 1 On utilise généralement µg/mL. Il convient de noter que les molécules CD40L appartiennent à la famille des ligands TNF, qui se caractérise par le fait qu'elles ne peuvent fonctionner qu'après avoir formé des trimères. Par conséquent, il est préférable d'utiliser une protéine trimère CD40L recombinante pour stimuler les DC, ce qui aura un bon effet. Si des monomères CD40L sont utilisés pour stimuler les DC, la maturité n'est pas très élevée dans la plupart des cas.
6. Choix de la méthode de formation
Tableau 1.Comparaison de trois méthodes expérimentales courantes pour la préparation du BMDC
| Paramètre | Méthode de culture classique BMDC - méthode Inaba | Préparation à grande échelle de BMDC - Méthode Son | Préparation à grande échelle de BMDC - méthode Lutz |
| Nombre de citations dans PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Hémolyse de la moelle osseuse, lyse des globules rouges | OUI | OUI | Non |
| La moelle osseuse élimine d'abord les lymphocytes | OUI | Non | Non |
| Élimination des granulocytes pendant la culture | OUI | Non | Non |
| Volume initial de placage des cellules de moelle osseuse | 1 ml | 15 ml | 10 ml |
| Incubateur | Plaques de culture cellulaire à 24 puits | Plaque de culture cellulaire à 6 puits | Boîte de culture bactérienne de 100 mm |
| Milieu de culture | RPMI 1640 + 10% FCS | ||
| Concentration de GM-CSF de souris | 200-1000 U/mL | La concentration initiale ajoutée est de 125-1000 U/mL Les 4e et 7e jours, des quantités suffisantes de GM-CSF et d’IL-4 sont ajoutées au système de culture. | La concentration initiale ajoutée est de 200 U/mL.3-100 U/mL après le 10ème jour |
| IL-4 de la souris | Il n'est pas nécessaire | Besoin，La concentration est la même que celle du GM-CSF | Il n'est pas nécessaire |
| Méthode d'échange de fluides | Le 2e et le 4e jour, jetez 50 à 75 % de l’ancien milieu de culture (qui contient des cellules) et remplacez-le par un milieu de culture complet et frais contenant suffisamment de GM-CSF. | / | Le 3ème jour, un volume égal de milieu de culture complet contenant du GM-CSF a été ajouté. Les 6ème, 8ème et 10ème jours, la moitié du milieu a été remplacée. L'ancien milieu de culture (contenant des cellules) a été aspiré, centrifugé, remis en suspension dans du milieu de culture complet frais contenant du GM-CSF puis remis en place. |
| Temps de culture avant le passage (expansion) | 6 jours | 7 jours | 10 jours |
| Temps de culture après passage (maturation) | 2 jours | Aucun | 1-2 jours |
| Inducteur de pleine maturité | TNF-α（250 U/mL） | LPS (1 à 10) (μg/mL) | TNF-α（250 U/mL）ou LPS(1 (μg/mL) |
| Moment de la récolte des cellules DC | 7-8 jours | 7-8 jours | 10-13 jours |
| Pureté DC | Jour 8：60-70% | Jour 7：85-95% | Jour 10-12：80-90% |
| Production DC/souris | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Réactifs de culture DC recommandés
| Nom du produit | Chat | Taille |
| 91108ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90621ES | 5 μg/20 μg/50 μg/500 μg | |
| 94016ES | 25 μg/100 μg/500 μg |