1.Contexte de la laminine 521
La laminine 521 (LN521) est une protéine d'adhésion cellulaire essentielle dans la niche naturelle des cellules souches et une matrice pour la culture et l'expansion des cellules souches embryonnaires humaines (hES) et des cellules souches pluripotentes induites (hiPSC). La LN521 se lie aux récepteurs de surface cellulaire et active les voies de signalisation cellulaire, ce qui entraîne la production de cellules plus fonctionnelles.
La laminine 521 reproduit l'environnement biologiquement pertinent des cellules souches embryonnaires humaines in vitro, favorise la fixation, la survie élevée et l'auto-renouvellement à long terme des cellules souches embryonnaires humaines, et est une protéine matricielle clé qui soutient la croissance des cellules souches et maintient la stabilité de la structure et des performances de la membrane basale. La laminine 521 est également l'une des matrices de culture sans nutriments les plus couramment utilisées. De plus, la laminine 521 peut permettre un passage efficace de cellules souches génétiquement stables et pluripotentes dans une cellule unique sans ajout d'inhibiteurs de l'apoptose. Les cellules se développent en monocouche uniforme sans qu'il soit nécessaire de retirer manuellement les zones de différenciation. De plus, des études ont montré que le LN521 peut soutenir la croissance des cellules souches embryonnaires humaines pendant plus de 10 générations sans aucun signe d'anomalie du caryotype, et maintient la capacité des cellules souches embryonnaires humaines à se différencier en trois couches germinales : les couches germinales interne, moyenne et externe.
Figure 1. Structure de la laminine 521 [1]
2.Expérience de revêtement de laminine
2.1 Préparer la laminine 521 à 400 µg/ml avec de l'eau déionisée stérile ou de l'eau pour préparations injectables. Il est recommandé de diluer à 100 µg/ml avec du DPBS stérile 1× (Ca++/Mg++) avant utilisation, puis de diluer à une concentration de travail de 5 à 10 µg/ml avec du DPBS stérile (Ca++/Mg++). La concentration de revêtement varie en fonction du type de cellules cultivées et il est recommandé d'optimiser le protocole expérimental pour déterminer la concentration de revêtement optimale pour les cellules. Se reporter au tableau 1 pour connaître les concentrations recommandées.
Note: DPBS contenant du Ca2+ et Mg2+ Il est recommandé d'utiliser des cations divalents, car ils sont importants pour la structure et la fonction des protéines. La concentration de travail requise de la laminine 521 dépend des cellules et de l'application. Nous recommandons une concentration initiale de revêtement de 0,5 μg/cm2.
Tableau 1. Volumes recommandés de solution de travail de laminine humaine recombinante pour différents récipients de culture.
| Boîte de Petri | Concentration du revêtement (μg/mL) | Quantité ajoutée de LN521 | Quantité supplémentaire de 1*DPBS | Volume total |
| 6 puits | 5 | 50 μL/puits | 950 μL/puits | 1 mL/puits |
| 12 puits | 5 | 25 μL/puits | 475 μL/puits | 0,5 mL/puits |
| 24 puits | 5 | 15 μL/puits | 285 μL/puits | 0,3 mL/puits |
| 48 puits | 5 | 7,5 μL/puits | 142,5 μL/puits | 150 μL/puits |
| 96 puits | 5 | 3,5 μL/puits | 66.5 μL/puits | 70 μL/puits |
| Boîte de Petri de 35 mm | 5 | 50 μL/puits | 950 μL/puits | 1 mL/puits |
| Boîte de Petri de 60 mm | 5 | 100 μL/puits | 1900 μL/puits | 2 mL/puits |
| Boîte de Petri de 100 mm | 5 | 300 μL/puits | 5700 μL/puits | 6 mL/puits |
Le volume ci-dessus est basé sur une concentration de revêtement de 5 μg/mL.
2.2 Ajoutez le volume spécifié de mélange laminine-DPBS dans chaque puits et agitez doucement. Assurez-vous que toute la surface est recouverte de solution de revêtement de laminine, car les surfaces non revêtues ne favorisent pas la croissance cellulaire.
2.3. Placer la plaque dans un incubateur à 37°C et laisser incuber toute la nuit. La durée d'incubation minimale est de 2 heures, mais une incubation toute la nuit est recommandée pour obtenir des conditions de culture cellulaire idéales. Veiller à ne pas laisser sécher le récipient de culture, ce qui inactiverait le LN521.
2.4. Lorsque les cellules sont prêtes à être ensemencées, aspirez la solution de laminine 521.
3. Culture iPSC
3.1 Décongélation des iPSC (en prenant comme exemple une plaque à 12 puits)
3.1.1 Retirer les iPSC de l’azote liquide ou de la glace sèche et les décongeler dans de l’eau à 37 °C pendant 10 secondes.
3.1.2 Stériliser les cryotubes avec de l’alcool à 75 % et les transférer sur un plan de travail.
3.1.3 Transférer les cellules dans un nouveau tube à centrifuger de 15 ml contenant 9 ml de DMEM-F12.
3.1.4 Centrifuger le tube à centrifuger de 15 mL à 300 g pendant 5 minutes à température ambiante.
3.1.5 Jetez la solution de laminine de la plaque à 12 puits revêtue.
3.1.6 Jetez le surnageant cellulaire et resuspendez délicatement les iPSC dans 1 ml de mTeSR-plus (contenant 10 µM de Y-27632) et transférez-les dans la plaque à 12 puits revêtue. Agiter la plaque pour répartir uniformément les cellules jusqu'à une densité cellulaire finale de 1 × 10^5 cellules/puits et laisser reposer à température ambiante pendant 10 minutes. Assurez-vous que la culture est transférée dans les 4 à 5 jours.
3.1.7 Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur à 37 °C pour l’incubation.
3.1.8 Le milieu de culture contenant l’inhibiteur ROCK doit être retiré après 12 à 16 heures et continuer à être cultivé dans le milieu sans inhibiteur.
Tableau 2. Densité d'ensemencement cellulaire dans différents récipients de culture, nombre de cellules déterminé en fonction du taux de croissance cellulaire
| Récipients de culture cellulaire | 6 puits | 12 puits | 24 puits | 96 puits |
| Numéro de portable | 2,5 à 3,5 × 105 | 6 à 8 × 104 | 3 à 4 × 104 | 0,5 à 1 × 104 |
3.2. Protocole de transmission iPSC
3.2.1 Jeter le surnageant de culture et rincer avec 1 ml de PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Note: Utilisez du PBS sans Ca2+ et Mg2+, car les cations divalents ont un effet négatif sur certaines enzymes de dissociation.
3.2.2 Jetez le PBS et ajoutez 0,5 mL de réactif de dissociation cellulaire doux.Incuber à température ambiante pendant 6 à 8 minutes ou observer au microscope jusqu'à ce que les cellules ne soient plus liées à la plaque.
3.2.3 Ajouter un volume égal de DMEM-F12, mélanger doucement les cellules, transférer dans un tube à centrifuger à température ambiante et centrifuger à 300 g pendant 5 minutes.
3.2.4 Avant de transférer les cellules, préparez une plaque à 12 puits recouverte de laminine.
3.2.5 Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans du milieu mTeSR-plus contenant 10 µM Y-27632.
3.2.6 Transférer les cellules dans la plaque à 12 puits recouverte de laminine préparée. Agitez doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules et laissez à température ambiante pendant 10 à 20 minutes.
3.2.7 Placer la plaque à 12 puits dans un incubateur à 37 °C et incuber.
Note: Les cellules iPSC se différencient rapidement et meurent après avoir atteint la monocouche. Pour maintenir leur croissance et leur pluripotence, elles doivent être soumises à un passage avant d'être confluentes.
3.3. Cryoconservation des cellules iPS
3.3.1 Préparez le réactif de dissociation cellulaire doux.
3.3.2 Effectuer la séparation des cellules selon le protocole de passage des iPSC, utiliser le nombre d'organites cellulaires pour garantir la densité cellulaire avant la cryoconservation.
3.3.3 Chaque tube de cellules doit être congelé à une densité cellulaire de 1-2×10^6. Suivre les étapes de centrifugation et d'élimination du milieu de culture cellulaire dans le protocole de passage des iPSC. Remettre en suspension le culot d'iPSC isolé dans un volume approprié de solution de cryoconservation
3.3.4 Ajouter 1 mL de culot de cryoconservation de cellules remises en suspension dans un tube de cryoconservation de 1,5 mL, effectuer le refroidissement du programme, puis transférer dans de l'azote liquide pour un stockage à long terme.
4. Remarques importantes sur le revêtement de laminine
4.1. Toutes les étapes du protocole expérimental doivent être réalisées dans des conditions stériles.
4.2. Évitez d’exposer la laminine à température ambiante pendant une longue période.
4.3. Évitez les congélations et décongélations répétées
4.4. Après décongélation, la solution mère de protéines non diluée peut être conservée à 2~8℃ dans des conditions stériles et peut être stockée de manière stable pendant au moins 3 mois.
5. Informations sur les produits associés
| Nom du produit | Chat# | Taille |
| Protéine humaine recombinante de laminine 521 (sans animaux) | 92602ES | 10 μg/100 μg/500 μg/1 mg |
6.Références
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. L'analyse cristallographique du bras court de la laminine β2 révèle comment le domaine LF est inséré dans un réseau régulier de domaines LE. Matrix Biol. 2017 Jan;57-58:204-212.