Puromycine est un antibiotique aminoglycoside produit par Streptomyces alboniger. C'est un analogue de l'extrémité 3' de la molécule d'aminoacyl-ARNt et peut se lier au site A du ribosome, s'incorporant dans la chaîne peptidique en extension, perturbant la translocation peptidique sur le ribosome, provoquant une terminaison prématurée de la chaîne pendant la traduction et inhibant ainsi la synthèse protéique.
Figure 1 Formule développée de la puromycine (CAS n° 53-79-2)
Le gène pac, codant pour la puromycine N-acétyltransférase (pac), a été trouvé dans la bactérie Streptomyces alboniger productrice de puromycine, conférant une résistance à la puromycine. Cette caractéristique est désormais largement utilisée pour le criblage de lignées cellulaires transfectées stables de mammifères portant des plasmides portant le gène pac. L'utilisation généralisée de la puromycine dans le criblage de lignées cellulaires stables est liée aux caractéristiques des vecteurs lentiviraux, dont la plupart portent le gène pac dans des vecteurs lentiviraux commerciaux. Dans certains cas spécifiques, la puromycine peut également être utilisée pour cribler des souches d'E. coli transformées par des plasmides portant le gène pac. La puromycine agit rapidement et peut provoquer rapidement la mort cellulaire à de faibles concentrations. Les cellules adhérentes de mammifères sont sensibles à des concentrations de 2 à 5 µg/mL de puromycine, alors que les cellules en suspension sont déjà sensibles à des concentrations aussi faibles que 0,5-2 µg/mL de puromycine. Des cellules de mammifères présentant une résistance stable à la puromycine peuvent être générées en une semaine.
Criblage de lignées cellulaires stables
Principe expérimental
En clonant l'ADN/shRNA exogène dans un vecteur portant le gène pac, le vecteur recombinant est transfecté dans les cellules hôtes et intégré dans leurs chromosomes, transmis de manière stable avec la division cellulaire et enfin criblé avec de la puromycine.
Préparation et pré-expérimentation
1 Concentrations d'utilisation recommandées
Cellules de mammifères : 1 à 10 μg/mL, la concentration optimale doit être déterminée au préalable.
E.coli : pour le dépistage des E. coli transformés stables porteurs du gène pac sur milieu gélosé LB, utiliser une concentration de 125 μg/mL. Un ajustement précis du pH est nécessaire pour le dépistage à la puromycine des transformants stables d'E. coli.
2 Méthode de dissolution
Dissoudre la puromycine dans de l'eau distillée pour préparer une solution mère de 50 mg/mL, filtrer, stériliser avec un filtre de 0,22 μm, aliquoter et conserver à -20°C.
3 Détermination de la courbe de destruction de la puromycine (en utilisant la transfection shRNA ou la transduction lentivirale comme exemple)
La concentration efficace de puromycine pour le dépistage est liée au type de cellule, à l'état de croissance, à la densité cellulaire, au métabolisme cellulaire et à la position du cycle cellulaire. Il est essentiel de déterminer la concentration minimale de puromycine qui tue les cellules non transfectées. Il est essentiel d'effectuer un dépistage par gradient de puromycine avant la première expérience afin d'établir une courbe de destruction.
- Cellules en plaques à une densité de 5~8×104cellules/puits dans une plaque à 24 puits et culture pendant la nuit.
- Préparez le milieu de criblage : milieu frais contenant différentes concentrations de puromycine (par exemple, 0 à 15 μg/mL, au moins 5 gradients).
- Remplacez par un milieu de criblage fraîchement préparé, continuez la culture et observez la croissance cellulaire, en changeant le milieu de criblage frais tous les 2 à 3 jours.
- Surveillez quotidiennement la survie des cellules ; la concentration de médicament qui tue efficacement toutes les cellules non transfectées en 4 à 6 jours est la concentration minimale.
Sélection de transfectants stables
- Après une infection lentivirale de 48 à 72 heures (confluence de 70 à 80 %), les cellules sont cultivées dans un milieu contenant une concentration appropriée de puromycine pendant au moins 48 heures. Lorsque toutes les cellules du groupe témoin non transfecté par la puromycine meurent, les cellules restantes du groupe infecté par le virus sont toutes des cellules positives.
【Remarque】: ① L'effet des antibiotiques est plus prononcé lorsque les cellules sont en phase de division active. L'efficacité des antibiotiques sera considérablement réduite si les cellules sont trop denses. La densité cellulaire ne doit pas dépasser 25 %. ② Observez quotidiennement l'état de croissance cellulaire ; le dépistage de la puromycine nécessite au moins 48 h et la concentration efficace du dépistage de la puromycine dure généralement de 3 à 10 jours. Plus le MOI du virus est élevé, plus chaque cellule contient de copies de shRNA et de gène de résistance à la puromycine. Lors du dépistage de la puromycine, plus le MOI est élevé, plus les cellules contiennent de copies de pac et plus la concentration de puromycine qu'elles peuvent tolérer est élevée. Ajustez la concentration de puromycine pour dépister les cellules transfectées, mais la concentration de puromycine ne doit pas être inférieure à la concentration efficace minimale de la courbe de destruction ;
- Ajoutez du milieu de culture contenant la concentration minimale de puromycine pour développer les cellules et, une fois les résultats du test qPCR qualifiés, procédez à la cryoconservation.
| Produitm nom | Chat# | Spécification | Apparence |
| Puromycine Dichlorhydrate CAS:58-58-2 | 60210ES25 | 25 mg | Poudre blanche ou blanche |
| 60210ES60 | 100 mg | ||
| 60210ES72 | 250 mg | ||
| 60210ES76 | 500 mg | ||
| 60210ES80 | 1 g | ||
| Puromycine (Solution 10 mg/mL) CAS:58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 mL | Solution (10 mg/mL dans H2O) |
| 60209ES50 | 5×1 mL | ||
| 60209ES60 | 10×1 mL | ||
| 60209ES76 | 50×1 mL |
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