- Arrière-plan
Les données résumées dans ce rapport sont réalisées par Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. pour MycAwayMT Kit de détection qPCR en temps réel de Mycoplasma (2G) produit.
Les données récapitulatives sont fournies uniquement à titre de référence pour l'utilisateur. L'utilisateur doit vérifier la méthode des mycoplasmes en utilisant ses propres échantillons pour confirmer que la méthode peut répondre aux exigences de l'utilisateur. Il est recommandé à tous les laboratoires qui utilisent ce kit de vérifier les paramètres suivants : limite de détection, spécificité et robustesse.
Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. peut fournir le rapport de qualification détaillé pour ce kit. Si l'utilisateur utilise ce rapport, seule l'adéquation (qui comprend la limite de détection et la spécificité) doit être vérifiée.
Contenu de la validation :
| Performance | Paramètres de validation | Résultats de validation |
| Limite de détection | Limite de détection de la souche de Mycoplasma | Limite de détection pour 10 types de mycoplasmes pharmacopéiens : 10 UFC/mL, chacun testé 24 fois avec un taux de détection ≥ 95 %. |
| Spécificité | Exemple d'interférence de matrice | J'ai testé 9 matrices d'échantillons et solutions de dilution d'ADN différentes, aucun mycoplasme n'a été détecté. |
| Réactivité croisée | Nous avons testé 14 souches et 6 cellules d'ingénierie couramment utilisées dans les produits biopharmaceutiques, aucun mycoplasme n'a été détecté. | |
| Durabilité | Stabilité au gel-dégel | Peut résister à 20 cycles répétés de gel-dégel sans affecter les performances du kit. |
| Stabilité de l'accélération thermique | Non affecté dans des conditions de 37°C pendant 14 jours et 4°C pendant 30 jours. | |
| Compatibilité des instruments | Compatible avec ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 et Roche LightCycler®480. | |
| Couverture | Couverture des types d'ADN de Mycoplasma | La comparaison de bases de données utilisant les séquences d'ARNr 16S de mycoplasmes couvre 183 espèces de la classe Mollicutes. |
- Matériel et méthodes expérimentales
2.1 MonAwayMT Kit de détection qPCR en temps réel de Mycoplasma (2G), fournisseur : Yeasen, n° de référence : 40619ES60.
2.2 MolPureMT Kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel magnétique, fournisseur : Yeasen, n° de référence : 18461ES60.
2.3 Les étalons de sensibilité aux mycoplasmes sont achetés auprès de Minerva Biolabs (MB), dont les souches proviennent de la National Collection of Type Cultures (NCTC). Les étalons de sensibilité sont des mycoplasmes inactivés et utilisés pour la vérification méthodologique de la méthode d'amplification des acides nucléiques (méthode qPCR/PCR) pour la détection des mycoplasmes. Au total, 10 types de mycoplasmes sont achetés, y compris les exigences des normes EP 2.6.7 et JP G3. Les informations sur les étalons sont les suivantes :
| Fournisseur | N° de chat. | N° NCTC | ATCC Non. | Nom du matériau |
| Minerva Biolabs (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Mycoplasma arginini |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Mycoplasma oral | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Mycoplasma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Mycoplasma pneumoniae | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Mycoplasma synoviae | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Mycoplasma fermentans | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Mycoplasma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Acholéplasma laidlawii | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Spiroplasma citri | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10 UFC™ Norme de sensibilité Mycoplasma salivarium |
2.4 Données originales : la version électronique a été enregistrée dans le « Rapport expérimental » le sous-fichier du fichier parent 'MycAwayMT Kit de détection qPCR en temps réel de Mycoplasma (2G).
2.5 Méthodes : Les matériaux et les méthodes de fonctionnement utilisés pour l'expérience ont été essentiellement produits ou définis par Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., qui ont été évalués et vérifiés pendant une longue période, le développement et la fabrication du kit sont suivis du système ISO 13485.
- Contenu et résultats des qualifications
3.1 Limite de détection (LOD)
L'extraction des acides nucléiques ainsi que la détection de la souche standard Mycoplasma à 10 UFC/ml ont été réalisées conformément aux instructions de la souche standard ainsi qu'aux instructions du kit d'extraction et de détection. Au total, 24 analyses ont été obtenues pour la souche standard Mycoplasma à 10 UFC/ml. Les échantillons NCS (échantillon témoin négatif) et NTC (échantillon témoin sans matrice) ont été testés simultanément dans chaque expérience.
Les résultats ont montré que les résultats NCS et NTC étaient satisfaisants et que les 24 échantillons de 10 UFC/mL étaient positifs, répondant ainsi à l'exigence d'avoir au moins 23 résultats positifs sur 24 tests.
| Non. | Nom du matériau | Concentration de liquide bactérien |
| 1 | Mycoplasma arginini | 10 UFC/ml |
| 2 | Mycoplasma oral | 10 UFC/ml |
| 3 | Mycoplasma gallisepticum | 10 UFC/ml |
| 4 | Mycoplasma pneumoniae | 10 UFC/ml |
| 5 | Mycoplasma synoviae | 10 UFC/ml |
| 6 | Mycoplasma fermentans | 10 UFC/ml |
| 7 | Mycoplasma hyorhinis | 10 UFC/ml |
| 8 | Acholéplasme Laissélawii | 10 UFC/ml |
| 9 | Spiroplasma citri | 10 UFC/ml |
| 10 | Mycoplasma salivarium | 10 UFC/ml |
Tableau 1 Informations sur les souches validées
| 10 UFC/ml | Expérience 1 | Expérience 2 | Expérience 3 |
| Taux de détection | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Total | 24/24 | ||
Tableau 2 Résultats de la limite de détection
3.2 Spécificité
3.2.1 Gamme de tests Mycoplasma
Les séquences de sondes d'amorces du kit ont été comparées au génome de l'ARNr 16S dans la base de données. Grâce à une analyse bioinformatique, il a été obtenu que le MycAwayMT Le kit de détection qPCR Mycoplasma (méthode de sonde) de NextSense Biologicals peut couvrir au moins 183 espèces de Zooxanthellae, dont 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma et 7 Cholestrongyla, etc.
3.2.2 Interférence de matrice d'échantillons
9 substrats (MEM de Dulbecco, milieu F-10 de Ham, milieu M-199, milieu F-12K de Ham, milieu RPMI-1640, McCoy 5A, milieu F-12K de Ham, milieu Kaighn + 1,0 mM/L de glutamine, L-15 LEIBOVITZ MEDTA + 2.0,5 mM de L-glutamine, DMEM-faible glucose Standard Medium) sont utilisés comme échantillons pour vérifier l'interférence de la matrice d'échantillon, les résultats ont montré que le milieu n'a aucune interférence avec les réactifs du kit.
3.2.3 Plage de détection des Flexibactéries
L'extraction et la détection de mycoplasmes inactivés (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) à 10 UFC/mL sont requises ainsi que les tests d'échantillons NCS et NTC.
Les résultats ont montré que NCS et NTC n’ont pas été détectés et les résultats étaient négatifs ; les 10 espèces de mycoplasmes ont été détectées et les résultats étaient positifs.
3.2.4 Réaction croisée
Pour 14 souches non flexibactériennes, dont Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), un certain nombre d'autres micro-organismes bacillus-coccus-champignons courants (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis et Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus), et six cellules modifiées (HEK293, 293T, Vero, CHO, E.coli, SF9) ont été utilisé pour la détection des mycoplasmes à l'aide du MolPureMT Kit de prétraitement d'échantillons d'ADN résiduel (bouteilles) et méthode des billes magnétiques et MycAwayMT Kit de détection qPCR Mycoplasma (méthode de sonde) (2G), et chaque expérience a été réalisée simultanément avec les tests d'échantillons PCS, NCS et NTC.
Les résultats ont montré que les résultats du PCS, du NCS et du NTC étaient satisfaisants ; les échantillons de test étaient négatifs et aucune réactivité croisée ne s'est produite.
3.3 Robustesse
3.3.1 Stabilité au gel-dégel
Le kit de test Mycoplasma a été soumis à des expériences de congélation-décongélation dans des conditions de -25℃~-15℃, et les résultats ont montré que le kit était capable de résister à 20 fois de congélation et de décongélation répétées, et que ses performances n'étaient pas affectées.
3.3.2 Stabilité accélérée
Le kit de détection de Mycoplasma a été accéléré par la chaleur à 37 ℃ pendant 14 jours et à 4 ℃ pendant 30 jours, respectivement, et les résultats ont montré que les performances du produit n'ont pas été affectées.
3.3.3 Applicabilité de l'instrument
Pour le kit de détection de mycoplasmes, différentes concentrations de contrôle positif et d'ADN de Mycoplasma pneumoniae dans le kit ont été utilisées comme échantillons à tester, et les expériences ont été réalisées sur quatre marques et modèles différents, à savoir, Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S et Roche LightCycler®480, respectivement.Les expériences ont été réalisées sur des instruments qPCR de quatre marques et modèles différents, Shanghai Hongshi SLAN-96S et Roche LightCycler®480.
Les résultats ont montré que les échantillons à tester ont été détectés sur des instruments qPCR de modèles de différents fabricants et que les résultats du contrôle négatif ont été qualifiés, et que les performances du kit n'ont pas été affectées.
- 4.Référence
4.1 Méthode d'examen des mycoplasmes <3301>. Pharmacopée chinoise, partie III [S]. Pékin : China Science and Technology Press, 2020 : 542-543.
4.2 Lignes directrices pour la validation des méthodes d'analyse <9101>. Pharmacopée chinoise, partie III [S]. Pékin : China Science and Technology Press, 2020 : 682.
4.3 Lignes directrices pour la validation des méthodes alternatives de tests microbiologiques des produits pharmaceutiques <9201>. Pharmacopée chinoise, partie III [S]. Pékin : China Science and Technology Press, 2020 : 684.
4.4 Mycoplasmes. Pharmacopée européenne[S]. 10e édition, 2020 : Section 2.6.7, 194-199.
4.5 Tests de mycoplasmes pour les substrats cellulaires utilisés pour la production de produits biotechnologiques/biologiques <G3-14-170>. Pharmacopée japonaise[S]. 18e édition, 2021 : 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J.Graham, et al. Impacts sur les attributs de qualité des produits des anticorps monoclonaux produits dans les cultures de bioréacteurs de cellules CHO lors d'événements de contamination intentionnelle par des mycoplasmes. Biotechnologie et bioingénierie. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Tests de mycoplasmes sur substrats cellulaires et produits biologiques : revue des techniques non microbiologiques alternatives. Mol Cell Probes. 2011 avril-juin ;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Une méthode de détection par PCR pour tester la contamination par Mycoplasma des vaccins vétérinaires et des produits biologiques. Lett dans Applied Microbiology. 2015 févr.;60(2):174-180.
Informations de commande
| Description | Numéro de pièce |
| Kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel magnétique MolPure® | 18461ES |
| Kit de détection de mycoplasmes par qPCR MycAway™ (2G) | 40619ES |