La recherche médicale progresse et la thérapie ciblée gagne en maturité. Le principe du traitement ciblé consiste à effectuer des tests génétiques sur les cibles moléculaires des médicaments afin d'identifier les mutations génétiques responsables de troubles héréditaires ou de tumeurs malignes. L'ARMS-PCR est une nouvelle méthode basée sur la PCR qui permet de détecter de nombreuses mutations ponctuelles de l'ADN. Actuellement, c'est l'une des méthodes les plus essentielles et les plus répandues pour l'identification génétique personnalisée des cancers. Les avantages de son utilisation thérapeutique sont largement reconnus par les experts du domaine.

1. Comment fonctionne la PCR spécifique à un allèle ?
2. Comment améliorer la spécificité ARMS ?
3. Quelles sont les caractéristiques des produits fournis par Yeasen ?
4. Que sont les données de performance du produit ?
5. Comment les gens commandent-ils des produits ?

1. Comment fonctionne la PCR spécifique à un allèle ?

ARMS-PCR signifie Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR), également connu sous le nom de PCR spécifique à l'allèle (AS-PCR). L'extension spécifique à l'allèle est régulée pour identifier l'allèle de type sauvage et le gène sauvage mutant, et la valeur du signal de fluorescence est mesurée à l'aide de la technique de la sonde Taqman.
Les amorces PCR ARMS sont conçues avec des nucléotides différents à l'extrémité 3' des deux amorces en amont de l'allèle, et les deux amorces sont, respectivement, spécifiques du type sauvage et du type mutant. Pendant l'amplification, les amorces en amont qui ne correspondent pas complètement au modèle sont incapables de former des paires de bases complémentaires, ce qui entraîne des mésappariements, une extension entravée et l'incapacité de générer des produits PCR, tandis que les systèmes d'amorces qui correspondent au modèle peuvent amplifier les produits PCR correspondants. Le fluorophore de la sonde Taqman peut émettre un signal fluorescent qui peut être détecté par le dispositif, et le génotype peut être validé en évaluant les données de fluorescence.
La technologie ARMS présente une sensibilité élevée, la limite de détection peut atteindre 100 copies/ml et la limite de détection pour les tissus tumoraux peut atteindre un taux de mutation de 0,5 %. De plus, l'ARMS prend du temps et est peu coûteuse, et les résultats sont intuitifs et faciles à évaluer. En effet, l'ARMS combiné à la technologie qPCR ou électrophorèse ne nécessite qu'une seule réaction PCR, ce qui prend moins de temps. Seules les amorces en amont doivent être optimisées pour la technologie ARMS, qui présente un coût inférieur et des résultats intuitifs par rapport à la technologie PCR en temps réel utilisant des sondes MGB. Étant donné que la majeure partie de l'ADN extrait des échantillons de tissus inclus dans la paraffine est fragmentée, des résultats de détection précis ne peuvent pas être obtenus. La méthode ARMS est conçue pour minimiser la longueur du produit cible, ce qui permet de résoudre cette difficulté dans les tissus inclus dans la paraffine. Dans le même temps, l'ARMS combiné à la plate-forme PCR réalise un fonctionnement en tube fermé, qui est simple à utiliser et ne nécessite pas de post-traitement du produit, évitant ainsi au maximum la contamination des produits d'amplification.
En théorie, l'ADN polymérase Taq doit être entièrement complémentaire de la matrice restante à l'extrémité 3' de l'amorce pour réaliser une polymérisation efficace. Cependant, la stringence de l'ADN Taq est affectée par plusieurs facteurs. Dans certains cas, une extension peut se produire même si la base terminale 3' de l'amorce n'est pas complémentaire de la matrice. S'il n'y a qu'une seule base non appariée à l'extrémité 3', les amorces peuvent être non appariées et étendues, mais l'efficacité de l'extension est faible. Différentes dislocations de l'extrémité 3' ont des efficacités d'extension différentes. Si d'autres bases non appariées sont introduites à l'extrémité 3', le nombre de mésappariements est trop important et l'extrémité 3' ne peut pas être étendue au-delà d'un certain niveau.Par conséquent, une seule incompatibilité de base à l'extrémité 3' de l'amorce ne peut pas distinguer correctement les deux allèles, ce qui entraîne des résultats faussement positifs.

2. Comment améliorer la spécificité ARMS ?

L'objectif de l'amélioration de la spécificité ARMS est d'améliorer la spécificité de l'extension d'amorce. Une base non appariée peut être introduite à la 2e ou à la 3e base à partir de l'extrémité 3'. Les bases non appariées agissent de concert avec les bases non appariées à l'extrémité 3' et, dans le modèle qui n'est pas complémentaire à l'extrémité 3', le taux de produit d'amplification de l'amorce est réduit. Alors que les amorces s'amplifient normalement dans les modèles complémentaires à leurs extrémités 3', le type de bases non appariées des amorces dépend du type d'incompatibilité de base à l'extrémité 3'.
Une fois les amorces spécifiques pour ARMS conçues, une paire de sondes TaqMan pour le transfert d'énergie de résonance de fluorescence spécifique à l'allèle est nécessaire. Les sondes TaqMan ont deux colorants fluorescents, l'extrémité 5' est un gène fluorescent et l'extrémité 3' a un gène d'extinction de fluorescence générale. Dans une sonde complète, le gène d'extinction et le gène fluorogène sont spatialement très proches l'un de l'autre, ce qui entraîne une extinction de fluorescence. Dans des circonstances normales, la fluorescence émise par le fluorophore à l'extrémité 5' ne peut pas être détectée, et seule la fluorescence de fond de l'extincteur à l'extrémité 3' peut être détectée. Dans le processus d'amplification du gène cible, les amorces PCR et les sondes marquées par fluorescence seront complémentaires de la séquence cible pendant la dé-OR. Lorsque l'enzyme Taq rencontre une sonde liée de manière stable au modèle lors de l'extension du brin modèle, l'exonucléase 5'-3' de l'enzyme Taq dégradera la sonde spécifique liée au modèle. Le fluorophore de la sonde est séparé par l'espace physique, l'effet d'extinction disparaît et la fluorescence est émise. Les incompatibilités entre les sondes faiblement fluorescentes et les séquences cibles réduisent la quantité de fluorescence libérée.

Figure 1 Concept fondamental de l'ARMS-PCR

3. Quelles sont les caractéristiques des produits fournis par Yeasen ?

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix est un kit basé sur le concept de bloc d'amplification qui permet un génotypage efficace médié par ARMS-PCR.

👍Haute sélectivité : capable d’identifier plusieurs mutations génétiques ;
👍Haute sensibilité : les amorces mutantes peuvent détecter des mutations à des concentrations aussi faibles que 0,5 % dans 10 ng/L d'ADN ;
👍Simple à lire : les résultats sont évidents et évaluée objectivement, et elle est simple et direct ;
👍Simple à utiliser : il est compatible avec une gamme d'équipements PCR, le mode de fonctionnement est standardisé et la détection embarquée peut être réalisée en 90 minutes.

4. Que sont les données de performance du produit ?

4.1 Impact de blocage du produit supérieur

Expérience : 5 L de matrice d'entrée, 10 ng/L de matrice de type sauvage et des quantités équivalentes de plasmide mutant ont été amplifiés à l'aide d'amorces mutantes
Site : KRASG13D (38G>A)
Rouge : 13 755 ; Bleu : concurrents

La figure 2 montre que les amorces de type sauvage amplifient à la fois les modèles de type sauvage et les modèles mutants. Selon la courbe d'amplification, le modèle de type sauvage n'a pas de pic ou la différence de valeur Ct entre le type sauvage et le mutant est de 6 à 8, ce qui permet de distinguer efficacement les gènes de type sauvage et mutants.

4.2 Le taux de détection du produit peut atteindre 0,05 %

Expérience 1 : Technique de préparation standard par auto-mélange (50 %) : 50 μL 10 ng/μL d'ADN de type sauvage et 50 μL 3X103 copies de plasmide mutant.
Site : KRASG13D (38G>A)

Figure 3. Selon la courbe d'amplification, le produit continue à fonctionner efficacement à une concentration de 0,05 %

Expérience 2 : Le standard acheté à 5 % (50 ng/μL) a été dilué avec un diluant de bibliothèque à 10 ng/μL, puis dilué à nouveau avec 10 ng/μL d'ADN 293 g à 0,1 % et 0,05 %.
Site : L858R
Rouge : 13 755 ; Bleu : concurrents

Figure 4 : Selon la courbe d'amplification, le taux de détection des loci sur un fond d'ADNg de type sauvage de 10 ng/μL peut atteindre 0,05 %, et la validation ultérieure par des normes commerciales démontre que nos produits ont un excellent taux de détection.

4.3 Excellente stabilité du produit

Les effets d’amplification et de blocage du produit ne sont pas affectés par 10 cycles de congélation et de décongélation.
Expérience : rouge : -20℃ ; vert : véritable gel-dégel 5 fois ; bleu : véritable gel-dégel 8 fois ; violet : véritable gel-dégel 10 fois.
Site : L858R

La figure 5 démontre que la congélation et la décongélation répétées du réactif 13755 dix fois n’ont aucune influence sur ses propriétés d’amplification et de blocage.

Ses effets d’amplification et de blocage ne sont pas affectés par 37 °C pendant 7 jours.
Expérience : Rouge : -20°C ; Vert & Violet : 37°C pendant 7 jours.
Site : L858R

La figure 6 démontre que sept jours à 37°C n’ont aucune influence sur l’action d’amplification et de blocage du réactif 13755.

5. Comment les gens commandent-ils des produits ?

Fondée en 2014, Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. est une entreprise de haute technologie spécialisée dans la recherche et le développement et la production de matières premières enzymatiques et d'anticorps antigéniques. Ses produits comprennent des enzymes de diagnostic moléculaire, des protéines et des anticorps utilisés dans les produits pharmaceutiques, les tests de sécurité alimentaire, l'élevage, la justice et d'autres industries. Nous nous engageons à fournir aux clients du domaine des sciences de la vie des produits et services de haute qualité. Les produits que Yeasen peut fournir sont les suivants :

Tableau 1 : Produits fournis par Yeasen