La valeur Ct est une représentation cruciale des résultats dans la PCR quantitative fluorescente. Elle est utilisée pour calculer les différences dans les niveaux d'expression des gènes ou le nombre de copies des gènes. Alors, quelle plage de valeurs Ct peut être considérée comme raisonnable dans la quantification par fluorescence ? Comment pouvons-nous garantir que les valeurs Ct se situent dans une plage efficace ? Aujourd'hui, laissons Xiao Yi répondre à cette question pour tout le monde.
Quelle est la valeur Ct ?
Dans le processus d'amplification qPCR, la valeur Ct fait référence au nombre de cycles d'amplification (seuil de cycle) auquel le signal de fluorescence du produit amplifié atteint le seuil de fluorescence défini. « C » signifie Cycle et « T » signifie Seuil. En termes simples, la valeur Ct est le nombre de cycles nécessaires au modèle de départ dans qPCR pour atteindre une certaine quantité de produit, ce qui sera expliqué plus en détail plus tard.
Quelle est la fonction de la valeur Ct ?
1. Relation entre l'amplification exponentielle, la quantité de modèle et la valeur Ct
Dans un scénario idéal, au cours de la qPCR, les gènes sont amplifiés de manière exponentielle et s'accumulent sur un certain nombre de cycles. La relation entre le nombre de cycles d'amplification et la quantité de produit peut être exprimée comme suit : la quantité de produit amplifié = quantité de matrice initiale × (1 + En)^nombre de cycles. Cependant, les réactions de qPCR ne se produisent pas toujours dans des conditions idéales. Lorsque la quantité de produit amplifié atteint une « certaine quantité de produit », le nombre de cycles à ce stade est la valeur Ct, indiquant la période d'amplification exponentielle. La relation entre la valeur Ct et la quantité de matrice initiale est la suivante : il existe une relation linéaire entre la valeur Ct d'une matrice et le logarithme du nombre initial de copies de cette matrice. Une concentration plus élevée de matrice initiale entraîne une valeur Ct plus faible, tandis qu'une concentration plus faible de matrice initiale entraîne une valeur Ct plus élevée.
2. Courbe d'amplification, seuil de fluorescence et une certaine quantité de produit
La quantité de produits d'amplification qPCR est directement représentée sous forme de signaux de fluorescence, connus sous le nom de courbe d'amplification. Dans les premières étapes de la PCR, lorsque l'amplification est dans des conditions idéales et que le nombre de cycles est faible, l'accumulation de produits est minimale et le niveau de fluorescence produit ne se distingue pas significativement du bruit de fluorescence de fond. Par la suite, la production de fluorescence entre dans la phase exponentielle. La quantité de produit PCR peut être détectée à un certain moment lorsque la réaction entre juste dans la phase exponentielle, ce qui est appelé la « certaine quantité de produit ». Cela peut être utilisé pour déduire le contenu initial du modèle. Par conséquent, l'intensité du signal de fluorescence correspondant à la certaine quantité de produit est connue sous le nom de seuil de fluorescence.
Dans les étapes ultérieures de la PCR, la courbe d’amplification ne présente plus d’amplification exponentielle et entre dans la phase linéaire et la phase de plateau.
3. La reproductibilité des valeurs Ct
Lorsque les cycles de PCR atteignent le nombre de cycles auquel la valeur Ct apparaît, on entre simplement dans la véritable phase d'amplification exponentielle. À ce stade, les erreurs mineures n'ont pas été amplifiées, de sorte que la reproductibilité des valeurs Ct est excellente. Cela signifie que, que le même modèle soit amplifié à des moments différents ou dans différents tubes en même temps, les valeurs Ct obtenues restent constantes.
Quelle est la plage des valeurs Ct ?
1. Efficacité d'amplification Fr
L'efficacité de l'amplification PCR fait référence à l'efficacité avec laquelle la polymérase convertit le gène cible en produits d'amplification.L'efficacité d'amplification est de 100 % lorsqu'une molécule d'ADN est convertie en deux molécules d'ADN. L'efficacité d'amplification est communément désignée par En. Pour faciliter l'analyse dans les articles suivants, voici une brève introduction aux facteurs qui affectent l'efficacité d'amplification.
| Facteurs d'influence | Explication | Jugements |
| A. Inhibiteurs de PCR | 1. L'ARN modèle peut contenir des substances qui inhibent la réaction PCR, telles que des protéines ou des détergents, entre autres. 2. L'ADNc obtenu après transcription inverse peut contenir des concentrations élevées d'ARN matrice et de composants des réactifs de transcription inverse, qui pourraient également inhiber la PCR ultérieure. | 1. La présence de contamination peut être évaluée en mesurant les ratios A260/A280 et A260/A230 ou en effectuant une électrophorèse d'ARN. 2. Après la transcription inverse, si l'ADNc est dilué dans une certaine proportion. |
| B. Conception déraisonnable de l'amorce | L'apprêt ne peut pas recuire efficacement. | Vérifiez s'il y a des dimères ou des structures en épingle à cheveux dans les amorces, et s'il y a des incompatibilités ; il est parfois nécessaire de prêter attention à la conception couvrant les introns. |
| C. Procédure de réaction inappropriée | 1. Les amorces ne peuvent pas s'hybrider efficacement. 2. L’activité de l’ADN polymérase n’est pas entièrement libérée. 3. En raison de températures élevées prolongées, l’activité de l’ADN polymérase diminue. | 1. La température de recuit est supérieure à la valeur Tm de l'amorce. 2. Le temps de pré-dénaturation est trop court. 3. La durée de chaque étape du protocole de réaction est trop longue. |
| D. Réactifs mal mélangés ou erreurs de pipetage | Dans le système de réaction, la concentration locale des composants de la réaction PCR est trop élevée ou inégale, ce qui entraîne une amplification non exponentielle de la PCR. | / |
| E. Longueur de l'amplicon | La longueur de l’amplicon est trop longue, dépassant 300 paires de bases, ce qui entraîne une faible efficacité d’amplification. | Vérifiez si la longueur de l’amplicon est comprise entre 80 paires de bases et 300 paires de bases. |
| F. L'impact des réactifs qPCR | Une concentration plus faible d'ADN polymérase dans les réactifs ou des concentrations d'ions sous-optimales dans le tampon font que l'enzyme Taq n'atteint pas son activité maximale. | La courbe standard est utilisée pour mesurer l'efficacité d'amplification des amorces. |
2. La plage des valeurs Ct
La plage des valeurs Ct est comprise entre 15 et 35. Une valeur Ct inférieure à 15 est considérée comme étant dans la phase de base et n'ayant pas atteint le seuil de fluorescence. Idéalement, il existe une relation linéaire entre la valeur Ct et le logarithme du nombre initial de copies du modèle, ce que l'on appelle la courbe standard. En utilisant la courbe standard, lorsque l'efficacité d'amplification est de 100 %, la valeur Ct pour quantifier une seule copie du gène est calculée à environ 35. Si la valeur Ct est supérieure à 35, théoriquement, le nombre initial de copies du modèle est inférieur à 1, ce qui peut être considéré comme statistiquement non significatif.
Pour différents gènes, la plage de valeurs Ct, en raison des variations dans la quantité initiale de copies de gènes et de l'efficacité de l'amplification, nécessite la création d'une courbe standard pour ce gène afin de calculer la plage de détection linéaire du gène.
3.Facteurs affectant les valeurs Ct
Comme l'indique la relation entre le nombre de cycles d'amplification et la quantité de produit : quantité de produit d'amplification = quantité de matrice initiale × (1 + En)^nombre de cycles, on peut voir que dans des conditions idéales, la quantité de matrice initiale et En auront un impact sur la valeur Ct. Les différences de qualité de matrice ou d'efficacité d'amplification peuvent entraîner une valeur Ct trop élevée ou trop faible.
4. Valeurs Ct trop élevées ou trop basses
Xiao Yi a consulté les experts du département technique de notre société et a résumé les causes et les solutions des deux types courants de problèmes avec les valeurs Ct pour éclairer nos lecteurs.
| Problème | Causes | Solutions |
| Valeur Ct trop élevée | La concentration du modèle est faible ou des inhibiteurs de PCR sont présents. L'efficacité d'amplification est faible. | 1. Augmentez la concentration du modèle ; ou augmentez le taux de dilution de l'ARN ou de l'ADNc ; ou préparez à nouveau le modèle. 2. Abaissez la température de recuit ou utilisez une méthode d'amplification en deux étapes ; assurez-vous que les composants et le système sont bien mélangés ; optimisez le protocole de réaction ; ou essayez de remplacer les réactifs. |
| Valeur Ct trop basse | 1. Concentration élevée de gabarit 2. Contamination dans le NTC (pas de contrôle de modèle) et le NRC (pas de contrôle inverse) 3. Conception d'amorce inappropriée | 1. Réduisez la quantité d’ARN modèle ou diluez l’ADNc à un rapport plus élevé. 2. Remplacez tous les réactifs à nouveau ou utilisez des réactifs anti-contamination UDGase. 3. Optimiser la procédure pour éviter une amplification non spécifique. |
Ceci conclut l'analyse des valeurs Ct anormales à l'origine de ce problème. Ensuite, Xiao Yi recommandera une gamme de produits rentables pour garantir que vos données expérimentales sont plus précises et fiables. Venez choisir vos favoris !
| Nom du produit | Chat# | Taille |
| Mélange maître Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green | 11184ES08 | 5×1 mL |
| Hifair™ Ⅲ SuperMix de synthèse d'ADNc 1er brin pour qPCR (digesteur d'ADNg plus) | 11141ES60 | 100 T |
| Mélange de digestion RT-gDNA en une étape Hifair™ AdvanceFast pour qPCR | 11151ES60 | 100 T |
| Kit de synthèse d'ADNc Hifair™ AdvanceFast 1er brin (sans colorant) | 11150ES60 | 100 T |