La PCR quantitative fluorescente (qPCR) est une technique couramment utilisée dans les laboratoires, qui peut être appliquée à l'analyse de l'expression génétique, au génotypage, à la détection de pathogènes, à l'analyse SNP, etc. Le fonctionnement de la qPCR est simple et son principe est facile à comprendre. Aujourd'hui, face à une pile de données désordonnées, analyser les résultats devient une tâche ardue. Aujourd'hui, Xiao Yi vous guidera sur la façon de simplifier les processus complexes et d'obtenir facilement des données pouvant être publiées dans les revues SCI !
Les méthodes d'analyse couramment utilisées en qPCR comprennent la quantification relative et la quantification absolue, et le choix entre ces méthodes doit être basé sur des plans expérimentaux différents. Dans ce numéro, nous nous concentrerons sur une application courante de la qPCR : l'analyse de l'expression génétique, où la méthode de quantification relative est généralement choisie.
Conception expérimentale
Supposons que nous ayons actuellement besoin d'étudier l'effet de l'induction lumineuse sur l'expression du gène AtSUC2 d'Arabidopsis. Le groupe témoin serait constitué de plantes d'Arabidopsis n'ayant subi aucun traitement, tandis que le groupe expérimental serait constitué de plantes ayant été traitées avec une certaine induction lumineuse. L'ARN serait extrait des deux groupes et rétrotranscrit pour obtenir de l'ADNc, qui serait ensuite utilisé comme modèle. Le gène GAPDH d'Arabidopsis serait sélectionné comme référence interne pour l'expérience qPCR.
Les puits qPCR qui doivent être configurés sont les suivants :
1) CNT (No Template Control) est utilisé pour vérifier s'il y a une contamination dans le système PCR.
2) NRT (Pas de transcription inverse) fait référence à l'utilisation d'ARN qui n'a pas subi de transcription inverse comme modèle, qui sert de contrôle pour la contamination de l'ADNg.
3) Le gène de référence interne est utilisé pour corriger les différences causées par les concentrations initiales variables des échantillons.
4) La sélection de échantillons de contrôle se répartit généralement dans les catégories suivantes :
- Pour évaluer l’effet d’un certain traitement sur l’expression génétique, l’échantillon non traité est utilisé comme échantillon de référence.
- Pour détecter les différences dans l’expression des gènes à différents moments, l’échantillon au moment 0 est utilisé comme échantillon de référence.
- Pour comparer les différences d’expression génétique entre différents tissus, un tissu est sélectionné arbitrairement comme échantillon de référence.
Il convient de noter ici que pour chaque matériau mentionné ci-dessus, 3 puits PCR (1, 2, 3) ont été mis en place. Il s'agit de duplicatas PCR, également appelés réplicats techniques, qui visent à éliminer les erreurs opérationnelles et à évaluer avec précision l'efficacité de l'amplification. De plus, des réplicats biologiques doivent être établis, ce qui implique de mener la même expérience sur différents matériaux (différents moments, plantes, lots, plaques de réaction) pour calibrer la variabilité biologique et analyser si le traitement a une signification statistique. Plus précisément, dans ce cas, le groupe expérimental et le groupe témoin nécessitent au moins deux autres ensembles d'échantillons d'Arabidopsis (A, B, C) à traiter. L'ARN est extrait de chaque ensemble et rétrotranscrit, suivi d'une qPCR. Pour l'analyse statistique, la moyenne des trois réplicats biologiques est utilisée.
Analyse des résultats — Méthode ΔΔCt
La caractéristique de la méthode ΔΔCt est qu'elle s'appuie uniquement sur les valeurs Ct pour le calcul, mais le principe est que l'efficacité d'amplification du gène cible et du gène de référence doit être relativement cohérente et tous deux se situer dans la plage de 90 à 110 %.
La formule de calcul spécifique est la suivante :
ΔCt = Ct (gène cible) - Ct (gène de référence)
ΔΔCt = ΔCt (groupe expérimental) - ΔCt (groupe témoin)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
En supposant que l'expérience ci-dessus étudie l'effet de l'induction lumineuse sur l'expression du gène AtSUC2 d'Arabidopsis, les résultats de la qPCR sont les suivants :
Lors du calcul, nous calculons d'abord la moyenne des données 2^-△Ct pour le groupe témoin (comme indiqué dans la figure ci-dessus, qui est de 0,00116). Ensuite, nous divisons chaque valeur de 2^-△Ct par cette moyenne pour obtenir la valeur de 2^-△△Ct. Enfin, nous organisons ces valeurs pour obtenir la moyenne et l'écart type, indiquant que le niveau d'expression du gène cible dans le groupe expérimental est augmenté d'environ 9,73 fois par rapport au groupe témoin.
Les résultats sont tracés à l'aide du logiciel Graphpad comme suit :
La valeur P calculée à l'aide du test t du logiciel est de 0,0024, ce qui est inférieur à 0,05, indiquant une différence statistiquement significative et les résultats sont fiables.
Analyse des résultats — Méthode de la double courbe standard
Dans les applications pratiques, l'efficacité d'amplification du gène cible et du gène de référence étant souvent différente, il est nécessaire de repenser les amorces et d'optimiser les conditions de réaction pour obtenir la même efficacité d'amplification. Cependant, nous pouvons également choisir une méthode plus pratique, l'approche de la double courbe standard.
Commençons par comprendre la méthode d'analyse de la quantification absolue. Les étapes spécifiques consistent à amplifier le fragment cible par PCR, puis à insérer le fragment cible dans un vecteur de clonage, à extraire le plasmide recombinant et, une fois le séquençage confirmé, à l'utiliser comme étalon. La quantité d'ADN plasmidique peut être mesurée à l'aide d'instruments tels que Nanodrop, et le nombre de copies est converti en copies plasmidiques spécifiques à l'aide de la formule de conversion du nombre de copies. Après cela, l'ADN est amplifié après une série de dilutions. Une courbe standard est tracée avec le logarithme du nombre de copies standard comme axe des x et les valeurs Ct mesurées comme axe des y. Sur la base de la valeur Ct de l'échantillon inconnu, son nombre absolu de copies peut être calculé.
Formule de calcul du nombre de copies :
Nombre de copies = (masse ÷ masse moléculaire relative) × 6,02 × 10^23
La méthode de la double courbe standard consiste à construire séparément des échantillons standards pour le gène cible et le gène de référence, à effectuer une quantification absolue et à créer des courbes standard. Après avoir calculé le nombre absolu de copies des échantillons inconnus, une comparaison est effectuée, offrant ainsi une plus grande précision.
La formule de calcul spécifique est la suivante :
Q = Nombre de copies du gène cible / Nombre de copies du gène de référence
RQ = Q (expérimental) / Q (témoin)
Dans l'expérience mentionnée ci-dessus, qui étudie l'effet de l'induction lumineuse sur l'expression du gène AtSUC2 d'Arabidopsis, des échantillons standards pour AtSUC2 et GAPDH ont été construits et les courbes standards suivantes ont été préparées :
Les valeurs Ct pour le gène cible et le gène de référence interne dans les échantillons à tester sont les suivantes :
Lors du calcul, les valeurs Ct du gène cible et du gène de référence interne sont d'abord substituées dans la relation linéaire de la courbe standard pour obtenir le nombre absolu de copies du gène cible et du gène de référence interne dans les groupes expérimental et témoin. Ensuite, en utilisant la formule Q = nombre de copies du gène cible / nombre de copies du gène de référence, le niveau d'expression du gène cible est normalisé.Enfin, selon la formule RQ = Q (expérimental) / Q (témoin), le RQ est calculé à 9,71, indiquant que le niveau d'expression du gène cible dans le groupe expérimental est 9,71 fois plus élevé que celui du groupe témoin.
Les résultats sont tracés à l'aide du logiciel GraphPad comme suit :
La valeur P calculée à l'aide du test t du logiciel est de 0,0008, ce qui est inférieur à 0,05, indiquant une différence statistiquement significative et les résultats sont fiables.
Ceci conclut l'analyse des données qPCR pour cette session. Ensuite, je recommanderai une gamme de produits rentables pour garantir que vos données expérimentales sont plus précises et fiables. Venez les récupérer !
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