La longueur d'un miRNA mature n'est que d'environ 20 nt, généralement l'amorce directe couvrira toute sa longueur ou aura même une partie excédentaire, et l'amorce inverse n'aura nulle part où être placée. La solution actuelle du marché consiste à augmenter la longueur de la transcription inverse pendant la transcription inverse. Les méthodes courantes incluent la méthode de la queue et la méthode de la tige-boucle.

1. Introduction
2. Produits recommandés
3. Liste des produits associés

1. Introduction

Les microARN (miARN) sont des petits ARN monocaténaires d'une taille d'environ 21 à 23 bases, qui sont générés à partir de précurseurs d'ARN monocaténaires avec une structure en épingle à cheveux d'environ 70 à 90 bases après traitement par l'enzyme Dicer. Le miARN se lie principalement spécifiquement à la région non codante de l'extrémité 3' de l'ARNm du gène cible et régule le processus de traduction de l'ARNm post-transcriptionnel du gène cible, bloquant ainsi la traduction de l'ARNm et favorisant la dégradation de l'ARNm, ce qui entraîne une diminution de l'expression des protéines. Le rôle des miARN est impliqué dans l'apparition et le développement de diverses maladies cardiovasculaires telles que l'ontogénie, la différenciation tissulaire, la prolifération cellulaire et l'apoptose.

Figure 1. Schéma de synthèse des miRNA in vivo

La longueur d'un miRNA mature n'est que d'environ 20 nt, généralement l'amorce directe couvrira toute sa longueur ou aura même une partie excédentaire, et l'amorce inverse n'aura nulle part où être placée. La solution actuelle du marché consiste à augmenter la longueur de la transcription inverse pendant la transcription inverse. Les méthodes courantes incluent la méthode de la queue et la méthode de la tige-boucle.

Figure 2. Synthèse de miRNA par la méthode de la queue

Figure 3. Synthèse de miRNA par la méthode de la tige-boucle

La méthode de queue utilise la polymérase PolyA pour ajouter une queue Poly(A) au miRNA mature et utilise Oligo-dT avec la séquence universelle comme amorce de transcription inverse pour synthétiser le miRNA allongé correspondant au premier brin d'ADNc. La méthode de la tige-boucle utilise la séquence universelle repliée dans la structure de la tige-boucle comme amorce pour synthétiser le premier brin de l'ADNc correspondant au miRNA allongé. La structure de la tige-boucle sera ouverte à une température appropriée pendant le processus d'amplification ultérieur. et combiné avec les amorces d’amplification pertinentes.

Tableau 1.Comparaison entre Tailing et Stem-loop

2. Produits recommandés

2.1 Combinaison quantitative d'inversion de queue de miRNA Yeasen (11148ES et 11171ES)

Figure 4. Kit de synthèse d'ADNc du premier brin de miRNA 11148ES-Hifair™

Le kit adopte la méthode de queue pour la transcription inverse de l'ADNc du premier brin de miRNA. Le tampon 2×Hifair™ miRNA RT du produit contient toutes les matières premières et amorces pour la réaction de queue de miRNA et la réaction de transcription inverse, et a été soigneusement optimisé. Il peut garantir que les processus de modification poly(A) et de transcription inverse de l'extrémité 3' du miRNA sont effectués efficacement et simultanément.

Figure 5. Mélange maître SYBR qPCR universel 11171ES-Hieff™ miRNA

Une nouvelle génération de réactifs de détection PCR quantitative par fluorescence prémélangés spécialement développés pour la détection quantitative des miRNA, contenant un colorant de référence passif spécial ROX, adapté à tous les instruments qPCR, pas besoin d'ajuster la concentration de ROX sur différents instruments, juste dans la réaction de préparation L'amplification peut être effectuée en ajoutant des amorces et des modèles au système. L'ADN polymérase adopte une polymérase à démarrage à chaud modifiée chimiquement et coopère avec un système tampon spécial, ce qui augmente la spécificité et la sensibilité de la réaction et permet de quantifier avec précision dans une plage plus large.

2.2 Performances du produit

2.2.1 Compatible avec tous les instruments qPCR sur plateforme

Figure 6. Résultats compatibles avec différents instruments qPCR

En utilisant l'ARN total des cellules 293T comme modèle, la transcription inverse a été réalisée avec le kit de synthèse d'ADNc Hifair™ miRNA 1st Strand (Cat# 11148ES).L'ADNc obtenu a été dilué 10 fois, puis utilisé Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) pour détecter les gènes de référence internes de hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p et U6, respectivement.

2.2.2 Taux de détection élevé, jusqu'à 10 pg

Figure 7. Diagramme d'amplification

Figure 8. Diagramme d'amplification

En utilisant l'ARN total synthétique hsa-miR-let-7e-5p(a) et 293T cell RNA(b) comme modèles, dilués respectivement aux gradients suivants : 60 copies à 606 copies (6 gradients) et 10 pg-100 ng (5 gradients), rétrotranscrits avec le kit de synthèse d'ADNc 1st Strand miRNA Hifair™ (Cat# 11148ES), et l'ADNc résultant a été détecté avec le Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) pour l'expression du gène hsa-miR-let-7e-5p.

2.2.3 Haute spécificité, capable de distinguer les différences de base unique entre les miRNA d'une même famille

Figure 9. Distinguer les différences de base unique entre les miRNA

La famille humaine hsa-let-7 possède plusieurs miRNA, avec peu de bases qui diffèrent les unes des autres, ou même une seule différence de base. Les miRNA synthétiques pour chaque isoforme Let-7 (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) ont été rétrotranscrits en ADNc à l'aide du kit de synthèse d'ADNc Hifair™ miRNA 1st Strand (Cat# 11148ES), en utilisant le Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) pour amplifier ces miRNA séparément avec différentes amorces, et calculer le taux de correspondance à l'aide de l'équation 2-ΔCT x 100 %. Les résultats montrent que les membres de la famille de sous-types étroitement liés peuvent être efficacement distingués.

2.2.4 Excellente efficacité d’amplification

Figure 10. Efficacité d'amplification

Figure 11. Efficacité d'amplification

Les gènes miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p ont été amplifiés en utilisant des cellules 293T humaines et de l'ARN total de foie de souris comme modèles. Les résultats ont montré que, par rapport à des produits similaires, le kit de synthèse d'ADNc du premier brin miRNA Hifair™ (réf. 11148ES) correspondait au système de réaction du Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (réf. 11171ES) avec d'excellentes performances.

2.2.5 Excellente stabilité

Figure 12. Analyse de la stabilité du produit à 37 ℃ pendant 7 jours

Figure 13. Analyse des résultats après 50 cycles de gel-dégel

Figure 14. Propriétés analytiques stables du système de réaction quantitative à différentes températures pendant 24 h

La transcription inverse a été réalisée avec le kit de synthèse d'ADNc du premier brin de miRNA Hifair™ (Cat# 11148ES) en utilisant l'ARN total des cellules 293T comme matrice, et l'ADNc obtenu a été dilué 10 fois et détecté avec le mélange maître qPCR universel SYBR Hieff™ miRNA (Cat# 11171ES). Expression de hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p. △Ct<0,5.

2.3 Combinaison quantitative d'inversion tige-boucle de miRNA Yeasen (11139ES et 11170ES)

Figure 15. Kit de synthèse d'ADNc 1er brin 11139ES-Hifair™ III (digesteur d'ADNg plus)

Le kit a été développé sur la base de la transcriptase inverse Hifair™ III.La vitesse de synthèse de l'ADNc enzymatique est rapide et la stabilité thermique est grandement améliorée. En même temps, l'enzyme améliore l'affinité avec le modèle et convient à la transcription inverse d'une petite quantité de modèles et de gènes à faible nombre de copies. La capacité de la transcriptase inverse Hifair™ III à synthétiser de l'ADNc pleine longueur a également été améliorée, permettant la synthèse d'ADNc jusqu'à 19,8 kb.

Figure 16. Mélange maître SYBR qPCR universel miRNA 11170ES-Hieff™

Ce produit est un mélange maître spécial pour la quantification des miRNA à l'aide de la méthode de fluorescence chimérique SYBR Green I. Étant donné que les séquences de miRNA sont courtes et que les séquences de miRNA d'une même famille sont souvent très similaires, la spécificité est extrêmement requise lors de la quantification. Ce produit est basé sur l'ADN polymérase à démarrage à chaud, avec un tampon optimisé, qui peut réduire considérablement l'amplification non spécifique ; en même temps, le colorant de référence ROX spécial rend le mélange maître adapté à tous les instruments qPCR, et il n'est pas nécessaire d'ajuster ROX sur différents instruments. L'amplification peut être réalisée en ajoutant des amorces et des modèles lors de la préparation du système de réaction.

2.3.1 Compatible avec tous les instruments qPCR sur plateforme

Figure 17. Résultats compatibles avec différents instruments qPCR

En utilisant l'ARN total des cellules hépatiques de souris comme modèle, la transcription inverse a été réalisée avec Hifair™ III 1st Strand
Kit de synthèse d'ADNc (digesteur d'ADNc plus) (Cat# 11139ES), et l'ADNc obtenu a été dilué 40 fois et utilisé Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) a été utilisé pour amplifier le gène humain mmu-miR-125a, respectivement.

2.3.2 Haute sensibilité, jusqu'à 10 pg

Figure 18. Détection de sensibilité

En utilisant l'ARN total des cellules hépatiques de souris comme modèle, la transcription inverse a été réalisée avec le kit de synthèse d'ADNc 1st Strand Hifair™ III (digesteur d'ADNg plus) (Cat# 11139ES), et l'ADNc obtenu a été dilué en série 10 fois (plage 10 pg/μL). -0,1 μg/μL), amplifier les gènes mmu-miR-125a, mmu-miR-132 et mmu-miR-351 d'origine murine.

2.3.3 Haute spécificité, capable de distinguer les différences de base unique entre les miRNA d'une même famille

Figure 19. Distinguer les différences de base unique entre les miRNA

La famille hsa-let-7 humaine possède plusieurs miRNA, avec peu de bases qui diffèrent les unes des autres, voire une seule différence de base. Ces miRNA ont été amplifiés séparément avec différentes amorces en utilisant Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES), et le taux de correspondance a été calculé à l'aide de la formule 2^-Δct x 100 %.

2.3.4 Bonne répétabilité

Figure 20. Détection de répétabilité

En utilisant l'ARN total des cellules 293T humaines comme modèle pour la transcription inverse, la transcription inverse a été réalisée avec le kit de synthèse d'ADNc 1er brin Hifair™ III (digesteur d'ADNg plus) (Cat# 11139ES), et l'ADNc obtenu a été dilué 50 fois et utilisé. Le Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) a été utilisé pour amplifier le gène hsa-let-7a humain dans une expérience de réplication à 90 puits.

2.3.5 Bonne stabilité

Figure 21.Analyse de stabilité du 11170ES à différentes températures pendant 14 jours

Figure 22. Analyse des congélations et décongélations répétées de 11170ES

Figure 23. Propriétés d'analyse stables du système de réaction quantitative à différentes températures pendant 24 h

L'ARN total des cellules hépatiques de souris a été utilisé comme modèle pour la transcription inverse avec le kit de synthèse d'ADNc 1st Strand Hifair™ III (digesteur d'ADNc plus) (Cat# 11139ES). L'ADNc obtenu a été dilué 100 fois pour amplifier le gène murin mmu-miR-132.

3. Liste des produits associés

Fondée en 2014, Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. est une entreprise de haute technologie spécialisée dans la recherche et le développement et la production de matières premières enzymatiques et d'anticorps antigéniques. Ses produits comprennent des enzymes de diagnostic moléculaire, des protéines et des anticorps utilisés dans les industries pharmaceutiques, les tests de sécurité alimentaire, l'élevage, la justice et d'autres industries. Nous nous engageons à fournir aux clients du domaine des sciences de la vie des produits et services de haute qualité. Les produits connexes fournis par Yeasen sont les suivants :

Tableau 2. Liste des produits associés