La PCR directe est une réaction qui utilise directement du sang, des tissus animaux ou végétaux, etc., pour l'amplification sans étapes d'extraction et de purification d'acides nucléiques. Elle apporte une commodité sans précédent à l'amplification de l'ADN, ce qui peut faire gagner beaucoup de temps. Quels sont donc les réactifs et produits utilisés dans la PCR directe ?

1. Qu'est-ce que la PCR directe
2. Quels réactifs sont nécessaires pour la PCR directe
3. Scénarios d'application et caractéristiques du kit PCR direct
4. Données sur le produit
5. Commentaires des clients
6. Informations sur la commande de produits

1. Qu'est-ce que la PCR directe

Après avoir été continuellement complétée et améliorée par d'innombrables chercheurs du monde entier, la technologie PCR est devenue la méthode de recherche fondamentale la plus largement utilisée, la plus fréquemment utilisée et la plus importante dans l'ensemble du domaine des sciences de la vie. La PCR Touch Down, la RT-PCR, la PCR en temps réel, la Multi PCR, etc. développées sur la base de la large application de la technologie PCR traditionnelle, ainsi que la dernière PCR numérique (Digital PCR), ont considérablement enrichi la recherche de la majorité des chercheurs scientifiques. Ces méthodes ont considérablement accéléré le développement des sciences de la vie modernes, en particulier la biologie moléculaire, et ont apporté de grandes contributions à la recherche sur la vie et la nature pour l'être humain tout entier. La technologie PCR traditionnelle et diverses nouvelles technologies et nouvelles applications qui en découlent ont une condition préalable, à savoir que des modèles d'acide nucléique de haute pureté doivent être obtenus à l'avance. Tout échantillon biologique doit passer par une série de traitements d'échantillons complexes et fastidieux pour obtenir des échantillons d'acide nucléique qui répondent aux exigences techniques de la PCR. La séparation et l'extraction de l'ADN et de l'ARN ont toujours été le travail de base que le personnel scientifique et technique concerné doit répéter chaque jour. En raison de la grande différence entre les échantillons, le processus de séparation et d'extraction de l'ADN et de l'ARN est également très différent. Ce travail nécessite un niveau élevé de compétence technique de la part des opérateurs. En raison de l'utilisation de certains réactifs chimiques hautement toxiques dans la technologie traditionnelle de séparation et d'extraction, une exposition à long terme entraînera des dommages irréversibles au corps de l'opérateur, voire des dommages directs pendant l'expérience. Les réactifs chimiques tels que le phénol et le chloroforme sont des cancérogènes importants en laboratoire, et l'azote liquide utilisé dans le processus de séparation et d'extraction des acides nucléiques des tissus végétaux représente une plus grande menace pour la sécurité des opérateurs pendant l'expérience en raison de sa température ultra-basse. Dans le même temps, pour ceux qui ont un grand nombre d'échantillons à étudier, la séparation et l'extraction des acides nucléiques sont une tâche à forte intensité de main-d'œuvre. Aujourd'hui, les kits d'isolement et d'extraction d'acides nucléiques sur le marché sont matures et il existe de nombreuses marques, mais ils sont tous à peu près les mêmes. Qu'il s'agisse d'un kit centrifuge sur colonne à membrane de silice ou d'un kit de méthode à billes magnétiques, il faut beaucoup de temps et le coût est élevé. Outre le coût du kit, il existe des exigences particulières en matière d'équipement de laboratoire. Le poste de travail automatisé utilisé dans la méthode des billes magnétiques est un équipement de grande valeur très typique à grande échelle, qui représente une dépense énorme pour le laboratoire. Pour résumer, avant de réaliser des expériences de PCR, le prétraitement des échantillons est un casse-tête inévitable et constant pour les chercheurs. Comment résoudre ce problème et réaliser directement des expériences de PCR sans séparation ni extraction des acides nucléiques a toujours été un problème auquel de nombreux chercheurs scientifiques et personnels de laboratoire clinique ont réfléchi.

La PCR directe est une réaction dans laquelle des tissus animaux ou végétaux sont directement utilisés pour l'amplification sans extraction d'acide nucléique. À bien des égards, la PCR directe fonctionne comme la PCR classique.La principale différence réside dans le tampon personnalisé utilisé dans la PCR directe. L'échantillon peut être directement soumis à une réaction de PCR sans extraction d'acide nucléique, mais il existe des exigences correspondantes concernant la tolérance des enzymes impliquées dans la réaction de PCR directe et la compatibilité du tampon. Bien qu'il y ait plus ou moins d'inhibiteurs de PCR dans les échantillons courants, la PCR directe peut toujours obtenir une amplification fiable sous l'action des enzymes et des tampons. Cependant, la réaction de PCR traditionnelle doit utiliser un acide nucléique de haute qualité comme modèle pour la réaction. Si le modèle contient des protéines et d'autres impuretés, il inhibera le bon déroulement de la réaction de PCR.

Le premier domaine d'application de la PCR directe est celui des animaux et des plantes, comme le sang, les tissus et les poils des souris, des chats, des poulets, des lapins, des moutons, des bovins et d'autres animaux ; les feuilles et les graines des plantes, etc. Elle est utilisée pour étudier le génotypage, la transgénèse, la détection des plasmides, l'analyse de l'inactivation des gènes, l'identification des sources d'ADN, l'identification des espèces, l'analyse des SNP et d'autres domaines. Ces domaines ont certaines caractéristiques communes, à savoir que le contenu du gène cible est relativement élevé et que l'extraction des acides nucléiques est difficile. Par conséquent, la PCR directe peut non seulement faire gagner du temps et avoir peu d'impact sur les résultats, mais aussi réduire les coûts.

2. Quels réactifs sont nécessaires pour la PCR directe

2.1 Échantillon de lysat

Vous pouvez préparer vous-même le lysat d'échantillon ou l'acheter. La différence entre les composants des différentes marques de lysat entraînera une capacité de lyse différente, puis une légère différence dans le temps de lyse. Par exemple, pour la préparation d'échantillons de tissus animaux, il est généralement recommandé de lyser pendant 30 minutes ou toute la nuit, et le lysat pour les virus varie de 3 à 10 minutes.

2.2 Mélange maître PCR

Il est recommandé d'utiliser une ADN polymérase à démarrage à chaud pour améliorer l'amplification spécifique et renforcer la capacité d'amplification. Au cœur de la PCR directe se trouve une polymérase hautement résistante.

2.3 Supprimer ou inhiber les composants des échantillons qui affectent l’amplification de l’ADN

Une fois l'échantillon traité par le lysat, des protéines, des lipides et d'autres débris cellulaires seront libérés et ces substances inhiberont la réaction de PCR. Par conséquent, la PCR directe doit ajouter des inhibiteurs ou des éliminateurs correspondants pour réduire l'influence de ces facteurs.

3. Scénarios d'application et caractéristiques du kit PCR direct

Le kit PCR direct de Yeasen peut amplifier directement les échantillons de plantes, de tissus animaux ou de sang, ainsi que d'autres échantillons originaux sans purification d'acide nucléique, ce qui simplifie grandement le processus expérimental de PCR. Le génotypage basé sur la PCR (Figure 1) a été réalisé en utilisant l'échantillon original sans purification du génome (Figure 1A) ou en utilisant son lysat (Figure 1B) comme modèle. Par rapport au génotypage basé sur la PCR générale, le kit PCR direct consomme moins d'échantillons, est simple à utiliser, a un faible coût expérimental et permet une détection quantitative d'échantillons de haute qualité.

Figure 1. Technologie PCR directe.

A. Méthode directe : prélevez un petit nombre d'échantillons et ajoutez-les directement au mélange PCR pour l'identification par PCR. B. Méthode de lyse : ajoutez l'échantillon à la solution de lyse pour libérer le génome, et ajoutez une petite quantité du surnageant de lyse au mélange PCR pour l'identification par PCR.

3.1 Applications

Détection d'amplification de gènes animaux, génotypage d'animaux transgéniques, identification de plantes transgéniques, génotypage de plantes, etc.

3.2 Caractéristiques

★   Direct : pas de purification d’ADN ;
★   Rapide : 10 min pour terminer la préparation du modèle, 50 min pour terminer la réaction PCR ;
★   Simple : les échantillons peuvent être lysés sans cisaillement ni broyage ;
PCR Mix se présente sous la forme d'un master mix, ce qui réduit les étapes d'ajout d'échantillons
★   Économie : moins de consommation de matière
★   Haut débit : la réaction de lyse peut être réalisée dans une plaque à 96 puits
★   Forte tolérance aux inhibiteurs

4. Données sur le produit

4.1 Type universel multi-animaux : kit PCR directe sur tissus animaux

4.1.1 Le plus rapide : raccourcir le temps de fonctionnement

Figure 2. Un kit de PCR directe sur tissu animal de Yeasen pourrait permettre de gagner plus de temps.

4.1.2 Exemple : Identification du génotype des souris knock-out

Figure 3. Résultats de l'amplification directe du tissu animal par kit PCR direct pour la détection des animaux dépourvus de gènes.

M : échelle d'ADN de 100 pb. Lignes 1 à 8 : lysat comme matrice. + : 50 ng d'ADN génomique purifié comme matrice. ﹣ : eau déionisée comme matrice. Plusieurs cycles : 35 cycles. Fragment unique (580 pb) : génome homozygote animal knockout. Fragment unique (180 pb) : génome de type sauvage. Deux fragments (580 pb/180 pb) : génome hétérozygote animal knockout.

4.2 Spécifique aux rongeurs : kit de PCR directe sur tissus de souris

4.2.1 Plus rapide : libération suffisante de gènes

Figure 4 Résultats d’amplification directe du kit PCR direct de tissus de souris avec différents temps de lyse.

M : échelle d'ADN de 100 pb. + : 50 ng d'ADN génomique purifié comme matrice. Plusieurs cycles : 35 cycles.

4.2.2 Meilleur que la méthode générale de lyse alcaline

Figure 5. Résultats de l’amplification du gène SOX21 de la queue de souris traitée avec différentes méthodes de lyse.

M : échelle d'ADN de 100 pb. Lignes 1-2 : lysat comme matrice par lyse alcaline générale. Lignes 3-4 : lysat comme matrice par kit de PCR directe sur tissu de souris. + : 50 ng d'ADN génomique purifié comme matrice. - : eau déionisée comme matrice. Plusieurs cycles : 35 cycles.

4.2.3 Comparer avec des produits similaires

Figure 6. Résultats de l’amplification du gène SOX21 de la queue de souris traitée avec des produits similaires de différentes marques.

M : échelle d'ADN de 100 pb. + : 50 ng d'ADN génomique purifié comme matrice. Plusieurs cycles : 35 cycles.

4.3 Kit PCR directe sur tissus végétaux

4.3.1 Vérification d'échantillons d'installations multi-types

Figure 7. Résultats de l’amplification directe des feuilles de différentes plantes.

M : échelle d'ADN de 100 pb. C : L'ADN génomique purifié comme modèle.Pistes 1-2 : Le lysat de tissu foliaire comme modèle. Plusieurs cycles : 30 cycles.

5. Commentaires des clients

5.1 Génotypage des souris

Figure 8. Résultats de l'identification du génotype de la souris à l'aide du kit PCR directe sur tissu de souris par les utilisateurs de Beijing Jishi Life Technology Co., Ltd.

5.2 PCR directe du riz

Figure 9. Amplification des gènes liés au riz à l'aide de kits de PCR directe sur tissus végétaux par les utilisateurs de l'Université agricole de Huazhong.

6. Informations sur la commande de produits

Yeasen est une société de biotechnologie spécialisée dans la recherche, le développement, la production et la vente de trois principaux réactifs biologiques : les molécules, les protéines et les cellules. Les produits proposés par Yeasen sont les suivants.

Tableau 1. Informations sur la commande de produits