Réussite révolutionnaire de Yeasen et la biotechnologie Molefuture

Avec le développement rapide de la biotechnologie, la thérapie par ARNm, en tant que méthode de traitement émergente, a suscité beaucoup d'attention en raison de sa forte programmabilité et de sa vitesse de réponse rapide. Dans des domaines tels que les vaccins à ARNm et la thérapie génique, la synthèse efficace d'ARNm de haute qualité est une étape cruciale pour atteindre les objectifs thérapeutiques. Dans ce processus, l'ARN polymérase T7 joue un rôle crucial, car elle peut catalyser efficacement la synthèse in vitro d'ARNm.

Le problème des sous-produits d'ARNdb de l'ARN polymérase T7

Bien que l'ARN polymérase T7 joue un rôle important dans la synthèse de l'ARNm, l'opération elle-même aboutit souvent à la production d'ARN double brin (ARNdb) comme sous-produit. La présence d'ARNdb réduit non seulement le rendement et la pureté de l'ARNm, mais peut également déclencher des réponses immunitaires non spécifiques, affectant l'efficacité et la sécurité. Par conséquent, la réduction de la production d'ARNdb est devenue un besoin urgent dans l'industrie. Actuellement, les méthodes de réduction de l'ARNdb consistent principalement à optimiser les conditions de réaction et à utiliser des enzymes auxiliaires. Bien que ces méthodes puissent réduire dans une certaine mesure la production d'ARNdb, elles posent souvent des problèmes tels qu'une opération complexe et des coûts plus élevés.

Pourquoi devrions-nous faire de l’ingénierie de l’ARN polymérase T7 ?

La modification directe de l'ARN polymérase T7 pour réduire la production d'ARNdb est une solution plus fondamentale. Les techniques d'évolution dirigée par les enzymes peuvent améliorer ses propriétés catalytiques et augmenter la pureté et le rendement des produits en modifiant précisément la séquence ou la structure des acides aminés de l'enzyme. Pour l'ARN polymérase T7, la modification ciblée peut non seulement réduire la production d'ARNdb, mais également améliorer l'efficacité et la qualité globales de la synthèse d'ARNm.

En tant que fournisseur de matières premières pour la synthèse in vitro d'ARNm, Yeasen Biotechnologie et sa filiale Molefuture Biotechnologie, avoir L'équipe d'évolution a mis au point une nouvelle ARN polymérase T7, en utilisant la plateforme d'évolution dirigée ZymeEditor. Afin de minimiser la production de sous-produits tels que l'ARNdb au cours des processus de transcription in vitro, l'équipe d'évolution a conçu l'ARN polymérase T7 grâce à une combinaison de conception rationnelle et de criblage dirigé.

Comment se génère l'ARNdb ?

Français Selon les rapports de la littérature, la production du sous-produit dsRNA provient principalement de deux sources (Figure 1) : La première est pendant la transition de l'ARN polymérase T7 de la conformation d'initiation à la conformation d'élongation dans les premiers stades de la transcription, le complexe ternaire de transcription est sujet à la dissociation [1], ce qui entraîne la libération d'un grand nombre de courtes chaînes d'ARN (ARN avorté) d'une longueur d'environ 20 nt dans le système. Ces chaînes d'ARN agissent comme des « amorces », s'appariant de manière complémentaire avec de longues chaînes d'ARN, et s'étendent pour produire de l'ARNdb sous l'action de l'activité ARN polymérase dépendante de l'ARN de l'ARN polymérase T7 (activité RDRP) [2,3]. La deuxième source est déclenchée par l'activité de transfert de ribonucléotides terminaux possédée par l'ARN polymérase T7. Lorsque la réaction de transcription atteint l'extrémité du modèle linéaire, l'ARN polymérase T7 peut ajouter au hasard plusieurs ribonucléotides sans dépendance au modèle. Ces ribonucléotides, formant des « amorces aléatoires », peuvent se replier en sens inverse et s'associer de manière complémentaire à la région d'ARNm cible, s'étendant pour produire un ARNdb. L'ARNdb produit par bouclage est appelé ARNdb en boucle [3,4]. Par conséquent, afin de réduire les sous-produits d'ARNdb, l'objectif de la modification de l'ARN polymérase T7 réside dans la stabilisation du complexe ternaire de transcription précoce ou dans l'affaiblissement de l'activité de transfert terminal et de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN (RDRP) activité de l'ARN polymérase T7.

Figure 1. Schéma de principe de la barrière énergétique et de la formation d'ARNdb (données non publiées)

Comment surmonter barrière énergétique de l'ARN polymérase T7 transition conformationnelle?

Grâce à l'analyse structurelle et à l'énergie libre, l'équipe a découvert, d'une part, qu'en plus des changements conformationnels de l'ARN polymérase T7, il y a également un changement d'énergie. L'énergie libre de la conformation d'élongation est significativement plus élevée que celle de la conformation d'initiation, ce qui indique que le processus de transcription doit surmonter une barrière énergétique plus élevée pour produire des chaînes d'ARNm complètes. Une barrière énergétique élevée est défavorable à une transition conformationnelle en douceur. Par conséquent, l'équipe a utilisé rationnel méthodes de criblage permettant d'identifier plus de 20 acides aminés à points chauds et de construire des bibliothèques de mutagenèse de saturation correspondantes.

Comment modifier le activités de transfert terminal et RDRP de l'ARN polymérase T7

D'autre part, compte tenu du peu de rapports sur les fonctions, les sites et les domaines structurels liés aux activités de transfert terminal et de RDRP de l'ARN polymérase T7, et parce que ces deux activités, qui sont fonctionnellement similaires, partagent probablement des sites clés avec la réaction principale de l'ARN polymérase T7 - ​​l'activité de transcription (c'est-à-dire l'activité de polymérisation de l'ARN dépendante de l'ADN, DDRP) - il est difficile de trouver des acides aminés de point chaud pour la modification dirigée vers le site. Par conséquent, l'équipe a construit simultanément plusieurs bibliothèques de mutations aléatoires basées sur la PCR sujette aux erreurs, combinées à la capacité d'évolution à haut débit de la plateforme ZymeEditor, ce qui a donné lieu à une diversité supérieure à 10^6 pour chaque bibliothèque individuelle.

Découverte de l'idéal par sonde ARN polymérase T7

Pour équilibrer la production d'ARN polymérase T7 et surveiller le contenu en ARNdb dans la réaction de transcription in vitro, l'équipe, en se référant à des modèles de transcription optimisés, a soigneusement conçu plusieurs Des sondes ciblant différentes régions des produits d'ARNm cibles. Ces sondes associent des informations telles que le rendement de réaction, l'intégrité et la teneur en ARNdb dans le système à des signaux de fluorescence. Plus l'intensité de fluorescence du système est forte, plus les performances du mutant sont avantageuses. En théorie, cette méthode de criblage peut classer les mutants en fonction de l'intensité de fluorescence de différentes sondes, en obtenant des mutants d'ARN polymérase T7 à rendement élevé ou à ARN abortif réduit, ainsi que des mutants à intégrité améliorée ou à ARNdb en boucle réduite. Lorsque le modèle de réaction est remplacé par de l'ARN, les mutants à activité RDRP réduite peuvent également être criblés négativement, améliorant ainsi la sélectivité du modèle de l'ARN polymérase T7. De plus, en ajoutant des nucléotides modifiés, des analogues de capuchon et en augmentant la température de réaction dans le système de réaction en gouttelettes, un criblage supplémentaire peut être effectué pour sélectionner des mutants d'ARN polymérase T7 qui tolèrent des substrats non naturels et présentent une stabilité thermique améliorée.

Comment effectuer le meilleur dépistage ARN polymérase T7?

En fonction de la taille des bibliothèques, l'équipe développé des processus de criblage à très haut débit basés sur le tri de gouttelettes activées par fluorescence (FADS) et des processus de criblage à haut débit basés sur des méthodes traditionnelles de microplaques (MTPS).Au cours de plusieurs séries d'expériences, plus de 10^7 mutants ont été examinés au total, ce qui a donné lieu à de nombreux mutants avec une teneur en ARNdb considérablement réduite. Parmi eux, certains mutants ont montré une diminution de l'ARNdb causée par l'ARN abortif dans la réaction, ce qui suggère que la conformation d'élongation de ces mutants de polymérase est plus stable. Certains mutants ont montré une diminution de la teneur en ARNdb de boucle de retour dans la réaction, indiquant un affaiblissement de l'activité de transfert terminal ou de l'activité RDRP chez ces mutants.

Étant donné que les avantages de performance des mutants susmentionnés proviennent de mécanismes différents, l'équipe a construit des bibliothèques de mélange d'ADN ciblant ces derniers. Après le criblage, l'équipe enfin obtenu des mutants aux performances supérieures avec une génération d'ARNdb extrêmement faible sans affecter les rendements et l'intégrité de l'ARNm (Figure 2). Cependant, les rendements d'un mutant G47A+884G découvert par Moderna ont été affectés^[5] (inédit).

Figure 2. Processus d'évolution enzymatique et caractérisation des performances des mutants

(inédit)

Analyse de la génération d'ARNdb par ARN polymérase T7 variantes ?

Après une analyse quantitative, comme le montre la figure 3, en utilisant un modèle de transcription de 9 kb dans des conditions de co-codage de transcription, l'ARN polymérase T7 de type sauvage a produit environ 2,9 ng/μg d'ARNdb en utilisant des nucléotides naturels, tandis qu'une Enzyme T7 produit environ 0,18 ng/μg d'ARNdb. Cependant, la production d'ARNdb de chaque variante d'ARN polymérase T7 construite était inférieure à 0,10 ng/μg. En particulier, une variante était seulement de 0,015 ng/μg, près de 200 fois inférieure au type sauvage et 12 fois inférieure au type commercial produit. Après des tests répétés, l'avantage de performance des variantes dans la réduction de l'ARNdb a été systématiquement observé dans différentes conditions de réaction, indiquant une bonne compatibilité du système de ces mutants et jetant les bases d'une réduction supplémentaire de la production d'ARNdb grâce au tampon de réaction optimisation. De plus, le criblage FADS a également permis d'obtenir plusieurs variantes avec une intégrité du produit et une stabilité thermique améliorées, ce qui peut répondre aux exigences d'une plus large gamme d'applications de transcription in vitro

Figure 3. Évaluation de la génération d'ARNdb par les variantes de l'ARN polymérase T7 évaluées à l'aide du kit ELISA d'ARN double brin (ARNdb) Yeasen et de l'analyse par transfert de points d'anticorps J2.

À l’heure actuelle, plusieurs partenaires ont déjà testé les variantes de l’ARN polymérase T7 et nous avons reçu de nombreux éloges de leur part. L’utilisation de la nouvelle enzyme simplifie le processus de purification de l’ARNm, améliore l’efficacité du travail et démontre des performances exceptionnelles dans de multiples scénarios d’application.

Ces variantes font l’objet de demandes de brevet et nous sommes ouverts aux discussions en vue d’une coopération technologique et d’un octroi de licences.

À propos de Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology est une filiale de Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., spécialisée dans la fourniture de solutions de modification enzymatique personnalisées basées sur la technologie d'évolution enzymatique.Tirer parti des ressources de Yeasen Biotechnologie, Molefuture opère sur six plateformes technologiques majeures : la plateforme innovante d'évolution enzymatique ZymeEditor, une plateforme d'expression multi-hôtes à haute efficacité, une plateforme de développement de processus de fermentation, une plateforme de développement de processus de purification, une plateforme de production d'enzymes ultra-propres et une plateforme d'analyse et de contrôle qualité des enzymes. Avec ces six plateformes technologiques, Molefuture peut offrir un ensemble complet de solutions personnalisées comprenant l'évolution dirigée par les enzymes, le développement de nouvelles enzymes, le développement de processus enzymatiques et la production à grande échelle au niveau des BPF pour répondre aux exigences d'application des enzymes dans des domaines tels que le diagnostic in vitro, la biomédecine, la biologie synthétique, l'esthétique médicale, les intermédiaires pharmaceutiques, etc.

Informations de commande

Voici quelques exemples de produits proposés par Yeasen. D'autres tailles sont disponibles. Nos produits sont hautement optimisés pour fonctionner de concert, afin de garantir des performances et une reproductibilité supérieures. Nous pouvons également fournir des services personnalisés. Si vous êtes intéressé par un produit qui n'est pas présenté, contactez-nous et nous travaillerons avec vous pour répondre à vos besoins.

Concernant la lecture :

Partage du rapport de validation du kit ELISA d'ARN double brin (dsRNA) pour promouvoir la standardisation de la détection d'ARNdb.

Références:

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA polymérase[J]. Progrès dans la recherche sur les acides nucléiques et la biologie moléculaire, 2003 : 1-41.

[2] Steitz T A. Les changements structurels de l'ARN polymérase T7 depuis l'initiation de la transcription jusqu'à l'élongation[J]. Opinion actuelle en biologie structurale, 2009, 19(6) : 683-690.

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, et al. Tri de gouttelettes activées par fluorescence pour une évolution dirigée à cellule unique[J]. ACS synthetic biology, 2019, 8(6) : 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. Les ajouts d'extrémité 3' par l'ARN polymérase T7 sont des modèles d'ARN auto-modélisés, distributifs et de caractère divers - analyses RNA-Seq[J]. Recherche sur les acides nucléiques, 2018, 46(18) : 9253-9263.

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM, et al. Une ARN polymérase T7 modifiée qui produit de l'ARNm exempt de sous-produits immunostimulateurs[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4) : 560-568.