Vous recherchez un moyen fiable de détecter l'ARNdb résiduel lors de la transcription in vitro de l'ARNm ? Ne cherchez pas plus loin que le kit ELISA pour ARN double brin (ARNdb). Cependant, avec plusieurs kits commerciaux disponibles, il est important de noter que les données de validation ne sont pas toujours accessibles au public, ce qui entraîne des incohérences dans la détection de l'ARNdb. C'est pourquoi nous partageons notre rapport de validation du kit ELISA pour ARN double brin (ARNdb), couvrant la spécificité, la précision, l'exactitude, la sensibilité et la durabilité. Ce rapport sert de guide de référence pour valider les méthodes de détection résiduelle d'ARNdb adaptées aux conditions expérimentales spécifiques et aux normes réglementaires des pharmacopées. Veuillez en savoir plus sur notre rapport de validation promouvoir la standardisation de la détection des dsARN.
ELISA pour ARN double brin (dsRNA) Kil
Arrière-plan:
Le kit ELISA d'ARN double brin (dsRNA) est un kit de réactifs conçu pour détecter l'ARN double brin résiduel produit pendant le processus de transcription in vitro de l'ARNm. Utilisant le principe expérimental du test immuno-enzymatique en sandwich à double anticorps (ELISA) et le système d'amplification biotine-streptavidine, ce kit offre une détection sensible de l'ARN double brin résiduel dans les échantillons.
Les données récapitulatives contiennent des paramètres de validation couvrant la spécificité, la précision, l'exactitude, la sensibilité et la durabilité. Le rapport sert de guide de référence, incitant les utilisateurs à valider les méthodes de détection résiduelle d'ARNdb adaptées à leurs conditions expérimentales spécifiques et conformes aux normes réglementaires de la pharmacopée.
Matériels et méthodes:
Trousse: Kit ELISA pour ARN double brin (dsRNA) : Cat#36717ES (YEASEN)Le kit comprend quatre types distincts d'échantillons standards d'ARNdb. Les utilisateurs ont la possibilité de choisir le type d'échantillon standard qui correspond à leur processus spécifique de génération de la courbe standard, évitant ainsi la nécessité de préparer et de tester tous les échantillons.
Méthodes : Les matériaux et les étapes de procédure essentiels à l'expérience sont principalement spécifiés par Yeasen Biotechnology. Le kit a subi des tests et des évaluations approfondis, garantissant que ses performances répondent aux exigences stipulées de l'ICH Q2(R1) et de l'édition 2020 de la Pharmacopée chinoise, partie quatre « 9101 Analytical Method Validation Guidelines ».
Résultats
- Linéarité des normes dsRNA
Ce rapport a développé des courbes standard pour les quatre types distincts de normes d'ARNdb, chacune d'une longueur de 300 pb. Ces normes comprennent STD1, ARNdb non modifié ; STD2, ARNdb modifié pseudo-UTP ; STD3, ARNdb modifié N1-Me-Pseudo-UTP ; et STD4, ARNdb modifié 5-OMe-UTP. Chaque type de norme d'ARNdb présente une excellente linéarité de dilution avec R2 > 0,99 et un coefficient de variation (CV) de la concentration mesurée inférieur à 10 % indiqué dans le tableau 1 à tableau 5.
| Nom de la MST | Type de câble UTP | Linéarité de la dilution (R2＞0,99) | CV |
| STD1 | UTP | 0.0156-1 pg/μL | ＜10% |
| STD2 | pUTP | 0,0156-1 pg/μL | ＜10% |
| STD3 | N1-Me-pUTP | 0,0312-1 pg/μL | ＜10% |
| STD4 | 5-OMe-UTP | 0,0625-1 pg/μL | ＜10% |
Tableau 1. Linéarité de différentes normes dsRNA.
| STD1 concn. (pg/μL) | Moyenne mesurée (pg/μL) | Récupération | CV |
| 1 | 1.0001 | 100,0% | 3,1% |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9% | 2,4% |
| 0,25 | 0,2516 | 100,7% | 3,3% |
| 0,125 | 0,1227 | 98,1% | 0,5% |
| 0,0625 | 0,0640 | 102,5% | 3,2% |
| 0,0312 | 0,0309 | 99,2% | 1,3% |
| 0,0156 | 0,0157 | 100,4% | 3,2% |
| 0 | / | / | / |
Tableau 2.La récupération et le CV de STD1 dilué
| STD2 concn. (pg/μL) | Moyenne mesurée (pg/μL) | Récupération | CV |
| 1 | 1.0001 | 100,0% | 0,7% |
| 0,5 | 0,4994 | 99,9% | 0,1% |
| 0,25 | 0,2514 | 100,6% | 0,9% |
| 0,125 | 0,1232 | 98,6% | 2,5% |
| 0,0625 | 0,0635 | 101,6% | 1,1% |
| 0,0312 | 0,0312 | 99,9% | 0,5% |
| 0,0156 | 0,0155 | 99,6% | 0,0% |
| 0 | / | / | / |
Tableau 3. La récupération et le CV de STD2 dilué
| Concentration STD3 (pg/μL) | Moyenne mesurée (pg/μL) | Récupération | CV |
| 2 | 2.0031 | 100,2% | 1.6% |
| 1 | 0,9880 | 98,8% | 2,4% |
| 0,5 | 0,5188 | 103,8% | 1,2% |
| 0,25 | 0,2383 | 95,3% | 2,2% |
| 0,125 | 0,1242 | 99,4% | 0,1% |
| 0,0625 | 0,0629 | 100,7% | 1,8% |
| 0,0312 | 0,0361 | 115,7% | 1,6% |
| 0 | / | / | / |
Tableau 4. La récupération et le CV de STD3 dilué
| Concentration STD4 (pg/μL) | Moyenne mesurée (pg/μL) | Récupération | CV |
| 4 | 4.0096 | 100,2% | 1,9% |
| 2 | 1,9940 | 99,7% | 0,7% |
| 1 | 0,9977 | 99,8% | 0,1% |
| 0,5 | 0,5108 | 102.2% | 0,1% |
| 0,25 | 0,2454 | 98,2% | 5,6% |
| 0,125 | 0,1207 | 96,5% | 2,8% |
| 0,0625 | 0,0624 | 99,9% | 0,3% |
| 0 | / | / | / |
Tableau 5. La récupération et le CV de STD4 dilué
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Spécificité
- Analyse de spécificité avec dsRNA, ssRNA, dsADN et ssADN.
- La spécificité n’a pas été affectée par la longueur des dsARN.
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UNprécision
Ajout de 0,5 pg/μL de STD1 Une analyse d'un échantillon d'ARNm connu avec une teneur en ARNdb de 0,36 pg/μL a été réalisée dans trois rapports de volume différents (1:1, 1:20, 1:250). Dans tous les cas, les taux de récupération des pics se situaient dans la fourchette de 80 à 120 %.
Le taux de récupération des pics est calculé comme suit : Pic Récupération Taux = (mesuré concentration après pic×Total volume de à pointes échantillon−Mesuré concentration de le échantillon×Total volume de le échantillon)/(Théorique concentration de le pic×Volume de le (pointe) × 100 %
| Échantillons | Rapport volumique de STD1/échantillon | ARNdb mesuré (pg/μL) | Pointe Récupération Taux |
| Échantillon (TS) | / | 0,36 | / |
| TS+0,5pg/μL STD1 | 1:1 | 0,769 | 81% |
| TS+0,5pg/μL STD1 | 1:20 | 0,777 | 82% |
| TS+0,5pg/μL STD1 | 1:250 | 0.803 | 82% |
Tableau 6. Taux de récupération des pics analyse
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Précision
- Précision intra-essai
Des expériences ont été menées sur trois niveaux de concentration (élevé, moyen et faible) pour chacun des quatre échantillons standards d'ARNdb. Dans une seule expérience, chaque échantillon de concentration a subi huit tests répétés. Les résultats montrent que le coefficient de variation (CV) est inférieur à 15 % indiquant une bonne précision intra-essai.
| STD1 | |||
| Théorique concn. (pg/μL) | Répliques | Moyenne mesurée (pg/μL) | CV |
| 1 | 8 | 1.0002 | 3,11% |
| 0,125 | 8 | 0,1230 | 0,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0164 | 3,18% |
| STD2 | |||
| Théorique concn. (pg/μL) | Répliques | Moyenne mesurée (pg/μL) | CV |
| 1 | 8 | 1.0001 | 0,65% |
| 0,125 | 8 | 0,1231 | 2,46% |
| 0,0156 | 8 | 0,0162 | 0,02% |
| STD3 | |||
| Théorique concn. (pg/μL) | Répliques | Moyenne mesurée (pg/μL) | CV |
| 2 | 8 | 2.0022 | 1,58% |
| 0,25 | 8 | 0,2444 | 2,17% |
| 0,0312 | 8 | 0,0328 | 1,64% |
| STD4 | |||
| Théorique concn. (pg/μL) | Répliques | Moyenne mesurée (pg/μL) | CV |
| 8 | 8 | 8.0803 | 0,27% |
| 1 | 8 | 0,9650 | 0,12% |
| 0,125 | 8 | 0,1322 | 2.76% |
Tableau 7. Analyse de précision intra-essai
- Précision inter-essais
Trois expériences ont été réalisées à l'aide de kits provenant de 3 lots. Dans chaque expérience, des concentrations élevées, moyennes et faibles ont été choisies et testées trois fois pour chacun des quatre échantillons standards d'ARNdb, avec huit répétitions. Par conséquent, 24 points de données ont été acquis à chaque niveau de concentration, qui ont ensuite été utilisés pour l'analyse du coefficient de variation (CV). Les résultats montrent que le CV pour chaque concentration des normes était inférieur à 15 %.
| STD1 | |||
| Théorique concn. (pg/μL) | Tests/répliques indépendants | Moyenne mesurée (pg/μL) | CV |
| 1 | 3/8 | 1.0007 | 2,38% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1186 | 3,20% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0173 | 1,27% |
| STD2 | |||
| Théorique concn. (pg/μL) | Tests/répliques indépendants | Moyenne mesurée (pg/μL) | CV |
| 1 | 3/8 | 0,9987 | 0,09% |
| 0,125 | 3/8 | 0,1269 | 1,06% |
| 0,0156 | 3/8 | 0,0151 | 0,52% |
| STD3 | |||
| Théorique concn. (pg/μL) | Tests/répliques indépendants | Moyenne mesurée (pg/μL) | CV |
| 2 | 3/8 | 2.0012 | 2,37% |
| 0,25 | 3/8 | 0,2415 | 0,14% |
| 0,0312 | 3/8 | 0,0330 | 1,81% |
| STD4 | |||
| Théorique concn. (pg/μL) | Tests/répliques indépendants | Moyenne mesurée (pg/μL) | CV |
| 8 | 3/8 | 7.9735 | 1,89% |
| 1 | 3/8 | 1.0225 | 0,13% |
| 0,125 | 3/8 | 0.1227 | 5,63% |
Tableau 8. Analyse de précision inter-essais
-
Sensibilité
- LOD
La limite de détection du trousse est déterminée en ajoutant deux fois l'écart type à la moyenne des valeurs à blanc. En mesurant la DO de 24 blancs, en calculant leur moyenne et leur écart type, puis en appliquant ces valeurs à la courbe ajustée, la limite de détection correspondante est obtenu.
|
| OD |
| ||
| ARNdb Standard | Moyenne du blanc | SD de Blanc | Moyenne du blanc + 2SD | LOD |
| STD1 | 0,016 | 0,00048 | 0,01696 | ≤0,001 pg/μL |
| STD2 | 0,016 | 0,00072 | 0,01744 | ≤0,001 pg/μL |
| STD3 | 0,034 | 0,00119 | 0,03638 | ≤0,001 pg/μL |
| STD4 | 0,115 | 0,00290 | 0,1208 | ≤0,01 pg/μL |
Tableau 9. Analyse LOD
- LQ
La limite quantitative de la trousse est établi en diluant le point de concentration le plus bas de la courbe standard à des niveaux encore plus bas, garantissant un CV < 20 % à la concentration la plus faible, définissant ainsi le seuil quantitatif. La limite de quantification est la suivante.
| ARNdb Standard | LQ | Répliques | CV (%) | Récupération (%) |
| STD1 | 0,0156 pg/μL | 24 | <10% | 80 à 120 % |
| STD2 | 0,0312 pg/μL | 24 | <10% | 80 à 120 % |
| STD3 | 0,0156 pg/μL | 24 | <10% | 80 à 120 % |
| STD4 | 0,125 pg/μL | 24 | <10% | 80 à 120 % |
-
Durabilité
- Anti-interférence sur les matériaux IVT
Ce test visait à évaluer l'impact de diverses enzymes, tampons, etc., ajoutés à la ARNm échantillon sur la détection d'ARNdb par le kit.
Ajout de concentrations spécifiques d'ARN polymérase T7, d'inhibiteur d'ARNase, d'IPPA (pyrophosphatase inorganique), d'ADNase I, de VCE (enzyme de coiffage de la vaccine), de 2'-O-méthyltransférase (MT), de tampon IVT 1× et de citrate de sodium 1 mM à un échantillon d'ARNm fourni, puis utilisation de STD3 pour la préparation de la courbe standard et les tests d'échantillons, a permis d'évaluer la capacité du kit à détecter la teneur en ARNdb dans ces Les résultats démontrent que la présence de huit enzymes et tampons différents n'a pas affecté la détection précise de l'ARNdb. De plus, les taux de récupération observés se situaient dans la fourchette de 80 à 120 %.
| Matériaux IVT | ARNdb Mesuré (pg/μL) | Récupération |
| Aucun | 0,6057 | 100% |
| ARN polymérase T7 (15 μg/mL) | 0,5411 | 89,32% |
| Inhibiteur de RNase murine (27,5 μg/mL) | 0,5142 | 84,88% |
| Pyrophosphatase inorganique (IPPA 10 μg/mL) | 0,7132 | 117,7% |
| DNase I (13,75 μg/mL) | 0,6077 | 100,32% |
| Enzyme de coiffage de la vaccine (10 μg/mL) | 0,6563 | 108,3% |
| 2´-O-méthyltransférase (10 μg/mL) | 0,5776 | 95,4% |
| 1×tampon IVT | 0,5003 | 82,6% |
| 1 mM Citrate de sodium | 0,6251 | 103,2% |
Tableau 11. Récupération du STD3 dilué ajouté avec des matériaux IVT
- Température durabilité
Les kits ont été stockés dans les deux 4°C et 37°C pour détecter les variations de concentration du standard dsRNA après 7 jours. Les résultats montrent que les variations sont toutes dans la limite de 20 %.
| ARNdb Standard | ARNdb Mesuré (pg/μL) Jour 0 | Les écarts après 7 jours à 4°C |
| STD1 | 1 | 10% |
| STD2 | 1 | 5% |
| STD3 | 2 | 7% |
| STD4 | 4 | 11% |
| ARNdb Standard | ARNdb Mesuré (pg/μL) | Les écarts après 7 jours à 37°C |
| STD1 | 1 | 18% |
| STD2 | 1 | 4% |
| STD3 | 2 | 5% |
| STD4 | 4 | 8% |
Tableau 12. Analyse de la durabilité en température
Produit associé:
| Nom du produit | UGS | Caractéristiques |
| Kit ELISA pour ARN double brin (dsRNA) | 36717ES | 48T/96T |
| ARN polymérase CleaScrip™ T7 (ARN ds faible, 250 U/μL) | 10628ES | 10/100 KU |
| ARN polymérase T7 Qualité GMP (250 U/μL) | 10625ES | 10/100 KU |
Lectures connexes :
Le kit ELISA d'ARN double brin (dsRNA) a été utilisé pour valider les mutants d'ARN polymérase T7 à faible dsRNA, en conjonction avec la méthode de transfert par points d'anticorps J2.
Références:
- ICH, 2022 : Validation de la méthode analytique T2, version préliminaire.
- NMPA, 2007 : Principes généraux pour l'évaluation de la validation des méthodes d'analyse pour le contrôle de la qualité des produits biologiques
- Commission de la Pharmacopée chinoise (ChPC), 2020 : Pharmacopée chinoise, quatrième partie : Lignes directrices pour la validation des méthodes d'analyse quantitative des échantillons biologiques