Ces dernières années, les médicaments à base d’ARNm ont suscité une attention considérable et ont attiré l’attention de la recherche. La T7 RNAP est connue pour sa simplicité et sa capacité à catalyser la synthèse d'ARN avec un rendement élevé et fidélité in vitro. Cependant, au cours du processus de transcription, l'ARN polymérase T7 peut produire des sous-produits tels que des ARN courts avortés, des ARN prématurément terminés et des ARN étendus en 3', ce qui crée des conditions favorables à la formation d'ARNdb. Par conséquent, la réduction de la production d'ARNdb est devenue un besoin urgent dans les applications pratiques.
Récemment, une étude révolutionnaire intitulée «La FADS et la conception semi-rationnelle ont modifié la production d'ARN polymérase T7 réduite par ARNdb, avec des activités de transférase terminale et de RDRP plus faibles" a été publié en ligne par Yeasen et l'équipe Molefuture. Les chercheurs ont réussi à concevoir l'ARN polymérase T7 pour réduire considérablement la production de sous-produits d'ARNdb pendant la transcription, la réduisant à 1,8 % de l'enzyme de type sauvage grâce à une combinaison d'évolution dirigée et de conception semi-rationnelle.
Criblage de l'ARN polymérase T7 basé sur FADS
Pour le criblage de l'ARN polymérase T7, le tri par gouttelettes activées par fluorescence (FADS) a été choisi pour répondre aux exigences de haut débit de l'évolution des protéines. Pour éviter la fragmentation prématurée des cellules, les chercheurs ont utilisé une puce PDMS à double phase aqueuse, où le lysozyme était mélangé aux cellules sur la puce et exerçait son activité dans les gouttelettes Figure 1Les chercheurs ont généré plusieurs bibliothèques de mutants aléatoires avec une diversité allant de 105 à106Après le dépistage, 10 variantes dominantes ont été identifiées et désignées comme Mut1 à Mut10. Comme indiqué dans Figure 2E et Figure 2F, la teneur en ARNdb de Mut1, Mut7 et Mut9 était significativement inférieure à celle du type sauvage
Figure 1. Aperçu du FADS
Figure 2. Criblage aléatoire de bibliothèques et évaluation des variantes
Conception semi-rationnelle de la RNAP T7
Chercheurs a mené une exploration de conception semi-rationnelle, créé dix bibliothèques saturées à site unique et utilisé la méthode traditionnelle de sondes doubles basée sur des plaques de microtitration pour le criblage (Figure 3). La sonde 5' ajoutée est utilisée pour la détection du rendement en ARN.
Figure 3. Conception semi-rationnelle guidée par la structure pour une diminution de l'ARNdb
Après avoir examiné plus de 1000 mutants, les chercheurs ont identifié six candidats : Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) et Mut16 (I743L). Le rendement total en ARN des six mutants ne différait pas significativement de celui du type sauvage, ce qui indique une efficacité de transcription globale comparable. Comme prévu, la teneur en ARNdb de Mut11 et Mut14 était significativement inférieure à celle du type sauvage(Figure 4).
Figure 4. Criblage sur plaque de microtitration et évaluation des variantes
Mut17 issu du mélange d'ADN produit moins d'ARNdb
Afin d'optimiser davantage l'ARN polymérase T7, quatre variantes à faible teneur en ARNdb tout en répondant aux exigences de production ont été sélectionnées.Les chercheurs ont ensuite construit une bibliothèque de mélange d'ADN et l'ont criblée avec des plaques de microtitration, et ont identifié une variante qui présentait une production d'ARNdb inférieure à celle de son ARNm T7 parental, appelée Mut17 (A70Q/F162S/K180E). Ils ont ensuite analysé les produits transcriptionnels de Mut17 et de ses variantes parentales (Mut14, Mut11 et Mut7). Comme le montre la figure Figure 5, les quatre variantes ont montré des réductions significatives de la production d'ARNdb pendant la transcription par rapport au type sauvage. Il est remarquable que Mut17 ait montré une teneur en ARNdb significativement plus faible de seulement 1,80 % et aussi faible que 0,007 ng/μg dans le système de solvants de criblage.
Figure 5. Teneur en ARNdb de Mut17 et de ses mutations parentales
L’immunogénicité du produit IVT du mutant est significativement inférieure à celle du type sauvage.
Suivant, Nous avons évalué l'immunogénicité des produits IVT dans la PR murineW264.7 cellules. Comme le montrent les figures 2A et 2B, les niveaux d'ARNm et de protéines de l'IFN-β ont été réduits dans la PRW264.7 cellules transfectées avec de l'ARNm produit par des mutants par rapport au type sauvage, indiquant que l'ARNm synthétisé par l'ARNm T7 de type sauvage a provoqué la réponse immunitaire la plus forte, tandis que l'ARNm des mutants a montré une réponse significativement réduite. Plus précisément, l'ARNm IFN-β des cellules traitées par l'ARN Mut11 ne représentait que 9,7 % de celui des cellules traitées de type sauvage, et sa teneur en protéines était de 12,93 pg/mL. De plus, l'expression de l'EGFP n'a montré aucune différence significative en quantité ou en qualité entre les ARNm générés par différentes RNAP T7 (Figure 6C), répondant aux exigences des applications industrielles.
Figure 6. Réponse de l'IFN-β et expression de l'EGFP dans les cellules de mammifères
Les activités RDRP et terminale transférase du mutant sont beaucoup plus faiblesnousr que ceux du type sauvage.
Pour étudier l’impact des mutations sur la réduction de l’ARNdb, les chercheurs Des études in silico ont été menées sur toutes ces mutations. Le résultat suggère une indication claire d'une activité RDRP réduite dans les variantes, car elles montrent une tendance réduite à utiliser l'ARN comme modèle. De même, cela peut avoir eu un impact sur l'activité de transférase terminale de l'ARN polymérase T7. Comme indiqué dans Chiffre 7, sous différentes concentrations, les 4 variantes ont présenté moins de 50 % de la valeur de fluorescence par rapport au type sauvage.
Par la suite, un test d'hétérogénéité de l'extrémité 3' a été utilisé pour caractériser l'activité de transfert terminal de l'ARN polymérase T7. En se concentrant sur la proportion d'ARN avec n> 0, qui reflète l'activité de transfert terminal, les chercheurs ont constaté que ces ARN représentaient 82,94 % dans le type sauvage, tandis que les mutants présentaient les pourcentages suivants : Mut11 (70,29 %), Mut7 (67,88 %), Mut14 (63,31 %) et Mut17 (55,62 %) (Chiffre 8)Il est important de noter que ces pourcentages sont très cohérents avec l’abondance d’ARNdb dans les produits (Figure 5)Ces résultats indiquent une réduction significative de l'activité de transférase terminale des mutants, qui, avec la diminution de l'activité RDRP, contribue à la diminution de l'ARNdb.Plus précisément, l'activité de transférase terminale peut jouer un rôle plus crucial, comme en témoigne la plus faible accumulation d'ARN n>0 observée dans Mut17, qui présente également la plus faible production d'ARNdb (Figure 5 et Figure 8).
Chiffre 7. Activité RDRP relative
Chiffre 8. Hétérogénéité dans l'extrémité 3' des produits d'ARN
Conclusion
Cette étude propose une méthodologie robuste pour identifier les mutants à teneur réduite en ARNdb et isole avec succès plusieurs mutants d'ARNdb présentant une activité réduite de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN et de la transférase terminale. Elle renforce considérablement la validation de l'innocuité et de l'efficacité des thérapies à base d'ARNm, soulignant ses profondes implications pour l'avancement des vaccins à ARNm et des applications de thérapie génique.
Dans le même temps, la société mère Yeasen a également lancé un produit T7 RNAP qui réduit considérablement l'ARNdb contenu. Plusieurs partenaires ont déjà testé les mutants T7 RNAP modifiés développés par Molefuture et le produit a été hautement reconnu par les clients. Nos clients pensent que l'utilisation de la nouvelle enzyme simplifie le processus de purification de l'ARNm et réduit considérablement l'immunogénicité de l'IVT produits, démontre des performances exceptionnelles dans de multiples scénarios d'application, prouvant son large potentiel d'application dans le domaine biopharmaceutique !
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