Kit de co-préparation de bibliothèque d'ADN et d'ARN Hieff NGS® V2 est un kit de co-bibliothèque ADN&ARN pour la plateforme de séquençage Illumina®&MGI®, qui contient un réactif de synthèse d'ADNc efficace et un réactif de digestion enzymatique. Par rapport à la bibliothèque traditionnelle construction méthode, ce produit peut compléter efficacement la synthèse d'ADNc et la bibliothèque d'ADN et d'ARN construction dans un seul tube. Le kit contient une enzyme de haute qualité pour la fragmentation de l'ADN et combine la fragmentation de l'ADN, la réparation des extrémités et la queue dA en une seule étape, ce qui réduit considérablement le temps et le coût de préparation de la bibliothèque. Ce kit de préparation de bibliothèque présente un excellent taux de conversion de bibliothèque et est applicable aux échantillons de tous les animaux, plantes, micro-organismes, etc. courants, ainsi qu'aux échantillons FFPE. Ce kit amélioré utilisant la dernière ligase optimisée diminue considérablement le taux d'auto-ligature pendant la ligature de l'adaptateur. De plus, l'introduction d'une nouvelle polymérase haute fidélité améliore encore l'homogénéité et la fidélité de l'amplification.

Tous les composants fournis par le kit ont subi un contrôle qualité strict et une vérification fonctionnelle, ce qui garantit au maximum la stabilité et la répétabilité de la construction de la bibliothèque.

Caractéristiques

Composants

Note: * indique que ce réactif n'est pas inclus dans ce kit et que des réactifs supplémentaires sont nécessaires.Le kit est compatible avec les plates-formes doubles de Illumina^®&MGI^®, mais un mélange d'apprêt supplémentaire (CAT # 13334 Mélange d'apprêt pour MGI^® et mélange d'amorces Cat# 13335 pour Illumina^®) est requis.

Déroulement du travail :

Stockage

Ce produit doit être conservé entre -25 et -15 ℃ pendant 1 année.

Remarques

À propos de l'opération

1. 1. Veuillez travailler avec des blouses de laboratoire et des gants jetables, pour votre sécurité.
2. Décongeler les composants à température ambiante.Après décongélation, bien mélanger au vortex, faire tourner brièvement le tube et le placer sur de la glace pour une utilisation ultérieure.
3. Il est recommandé d'effectuer chaque étape de réaction dans un thermocycleur avec un couvercle chauffant. Le thermocycleur doit être préchauffé à la température définie avant utilisation.
4. Veuillez utiliser des consommables sans RNasecontamination, et nettoyage de la zone expérimentale régulièrement. RNAZap de ThermoFisher^MT Un spray d'élimination des acides nucléiques à haute efficacité a été recommandé pour éliminer la contamination par l'ARNase.
5. Des opérations incorrectes peuvent très probablement provoquer des contaminations par aérosols, affectant la précision des résultats.Il est recommandé d'isoler physiquement les zones de mélange des réactions PCR et les zones de purification des produits PCR. Equipé d'équipements tels que des pipettes spécialisées pour la construction de bibliothèques.
6. 6. Ce produit est destiné à la recherche uniquement.

Ligature de l'adaptateur

1. Des kits d'adaptateurs longs (adaptateurs à code-barres) Illumina ou MGI et des kits d'adaptateurs courts sont disponibles pour que les clients puissent choisir en fonction de leurs besoins expérimentaux.
2. Il a été recommandé de sélectionner des adaptateurs commerciaux de haute qualité. Si vous choisissez des adaptateurs fabriqués par vos soins, veuillez faire appel à une entreprise expérimentée dans la synthèse d'amorces NGS et notez la nécessité d'un contrôle strict de la contamination. De plus, il est recommandé de préparer la solution de recuit d'ADN dans un banc propre et d'utiliser uniquement un type d'adaptateur à la fois pour éviter toute contamination croisée.
3. Veuillez décongeler les adaptateurs sur la glace ou à 4°C ; en fonctionnement à température ambiante, la température du laboratoire ne doit pas dépasser 25°C pour éviter la dénaturation des adaptateurs.
4. La concentration de l'adaptateur affecte directement l'efficacité de la ligature et le rendement de la bibliothèque. Le volume d'adaptateur ajouté au kit est fixé à 5 μl. Il est recommandé de diluer les adaptateurs avec un tampon 0,1×TE et les adaptateurs dilués peuvent être conservés à 4°C pendant 48 heures. Tableau1 répertorie la quantité d’adaptateur recommandée pour différentes quantités d’ARN d’entrée.

Tableau 1-1 L'Illumina recommandé^® quantité d'adaptateur pour différentes entrées ADN et ARN

Tableau 1-2 Le MGI recommandé^® quantité d'adaptateur pour différentes entrées ADN et ARN

*L'utilisation de l'adaptateur peut être ajustée en fonction de différents types d'échantillons d'ARN total et de la quantité d'entrée.

Amplification de la bibliothèque

Le nombre de cycles d'amplification doit être strictement contrôlé. Une amplification insuffisante peut entraîner un faible rendement de la bibliothèque. Une suramplification peut entraîner une augmentation des biais, des erreurs, des lectures dupliquées et des produits chimériques. Tableau 2 répertorie les numéros de cycles recommandés ciblant le rendement de la bibliothèque de 1 μg.

Tableau 2 Le nombre de cycles recommandé pour générer une bibliothèque d'ADN et d'ARN *

Remarque : * Le rendement de la bibliothèque n'est pas seulement lié à la quantité d'entrée et au nombre de cycles d'amplification, mais également affecté par la qualité des échantillons, les conditions de fragmentation et les conditions de tri. Lors du processus de construction de la bibliothèque, choisissez les conditions les plus appropriées en fonction de la situation réelle.

Nettoyage et sélection de la taille de l'ADN à partir de billes

1. 1. Le processus de construction d'une bibliothèque comprend plusieurs étapes qui nécessitent la purification de l'ADN par des billes magnétiques. Nous recommandons les billes de sélection d'ADN Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) ou les billes magnétiques AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) pour la purification de l'ADN et la sélection de la taille.
2. 2. Les billes magnétiques doivent être équilibrées à température ambiante avant utilisation, sinon le rendement diminuera et l'effet de sélection de taille sera affecté.
3. 3. Les billes magnétiques doivent être bien mélangées par vortex ou pipetage avant utilisation.
4. 4. N'aspirez pas les billes lors du transfert du surnageant, même des traces de billes peuvent avoir un impact sur les réactions suivantes.
5. 5. L'éthanol à 80 % doit être fraîchement préparé, sinon cela affectera l'efficacité de la récupération.
6. 6. Les billes magnétiques doivent être séchées à température ambiante avant d'éluer le produit. Une sécheresse insuffisante peut facilement entraîner un effet résiduel de l'éthanol sur les réactions ultérieures ; une sécheresse excessive peut provoquer la fissuration des billes magnétiques et réduire le rendement de purification. Normalement, un séchage à température ambiante pendant 3 à 5 minutes suffit pour permettre aux billes de sécher complètement.
7. 7. Si nécessaire, les échantillons d'ADN purifiés ou sélectionnés par taille élués dans1× Le tampon TE peut être conservé à 4°C pendant 1 à 2 semaines ou à -20°C pendant un mois.

Analyse de la qualité de la bibliothèque

1. La qualité des bibliothèques construites est généralement analysée en mesurant les concentrations et les distributions de taille.
2. Les concentrations des bibliothèques peuvent être mesurées par des méthodes basées sur la fluorescence telles que Qubit et PicoGreen ou qPCR.
3. Il n'est PAS recommandé d'utiliser des méthodes de quantification basées sur l'absorbance telles que NanoDrop.
4. Il est recommandé d'utiliser la méthode qPCR pour la quantification des bibliothèques : les méthodes basées sur la fluorescence telles que Qubit et PicoGreen ne peuvent pas différencier les structures d'ADN double brin incomplètes (inserts sans adaptateur ou avec une seule des extrémités ligaturée avec un adaptateur) des bibliothèques complètes. La méthode qPCR n'amplifiera et ne mesurera que les bibliothèques complètes avec les deux extrémités ligaturées avec des adaptateurs (les bibliothèques séquencables), offrant ainsi une mesure plus précise pour le chargement.
5. La distribution de taille des bibliothèques peut être analysée à l'aide d'Agilent Bioanalyzer ou d'autres appareils basés sur les principes de l'électrophorèse capillaire ou de la microfluidique.

Autres matériaux

1. 1. Billes magnétiques de purification d'ADN : Billes de sélection d'ADN Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) ou AMPure^®Perles XP (A63880) ou autres produits équivalents.

2.Adaptateurs : Adaptateur complet pour Illumina (Yeasen Cat#13519-13520 ou autres produits équivalents) ou Adaptateur complet pour MGI (Yeasen Cat#13360-13362 ou autres produits équivalents).

3. Analyse de qualité de bibliothèque : Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/High Sensitivity Chip ou autres produits équivalents ; réactifs quantitatifs de bibliothèque.
4. Autres matériels : éthanol absolu, eau ultra pure stérile, pointes de pipettes à faible rétention, tube PCR, supports magnétiques, thermocycleur, etc.

Documents:

Manuels

12305ES-Kit de copréparation de bibliothèque d'ADN et d'ARN Hieff NGS® V2.pdf