Description
Description du produit
Le kit de préparation de bibliothèque d'ARN bimode Hieff NGS™ Ultima est un kit de construction de bibliothèque de séquençage d'ARN total pour la plateforme de séquençage Illumina® et MGI®, comprenant des réactifs de fragmentation d'ARN, des réactifs de transcription inverse, des réactifs de synthèse ds-ADNc conventionnels et spécifiques à un brin et des réactifs d'amplification de bibliothèque. La bibliothèque de séquençage peut être construite suivie du kit de purification d'ARNm ou du kit d'élimination d'ARNr. Le module de synthèse à deux brins est équipé de deux tampons pour répondre au besoin d'une bibliothèque conventionnelle ou d'une bibliothèque spécifique à un brin. Parmi eux, le dTTP est remplacé par le dUTP dans le tampon de synthèse à deux brins spécifique à un brin, de sorte que le dUTP peut être ajouté au deuxième brin d'ADNc. L'ADN polymérase haute fidélité utilisée dans ce kit ne peut pas amplifier la matrice d'ADN contenant de l'uracile, ce qui permet d'obtenir une spécificité de brin. Tous les réactifs fournis ont subi un contrôle qualité strict et une vérification fonctionnelle, garantissant au maximum la stabilité et la reproductibilité de la construction de la bibliothèque.
Flux de travail
Composants du produit
| Composants | 12308ES24 | 12308ES96 | |||
| 12308-A | Tampon Frag/Prime 2× | 250 μL | 930 μL | ||
| 12308-B | Mélange d'enzymes 1er brin | 48 μL | 192 μL | ||
| 12308-C | Réactif de spécificité de brin | 150 μL | 580 μL | ||
| 12308-D | Tampon 2ème brin (dNTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-F | Tampon 2ème brin (dUTP) | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-F | Mélange maître d'enzymes à 2 brins | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-G | Stimulateur de ligature | 720 μL | 2×1440 μL | ||
| 12308-H | Nouvelle ADN ligase T4 | 120 μL | 480 μL | ||
| 12308-I | 2×Super Canace® II Mixage Haute Fidélité | 600 μL | 2×1200 μL | ||
| 12308-K | H2O sans nucléase | 300 μL | 1000 μL | ||
Remarque : ce kit est compatible avec les plateformes Illumina et MGI, mais des Illumina supplémentaires ou MGI Mélange d'amorces (Cat# 13335 Mélange d'amorces pour Illumina et mélange d'amorces Cat# 13334 pour MGI ) est requis.
Expédition et stockage
Les composants du kit de préparation de bibliothèque d'ARNm bimode Hieff NGS™ Ultima de la boîte I sont expédiés avec des packs de glace et peuvent être stockés entre 2 et 8 °C pendant un an.
Les composants du kit de préparation de bibliothèque d'ARNm bimode Hieff NGS™ Ultima de la boîte II sont expédiés avec de la glace sèche et peuvent être stockés à -20 °C pendant un an.
Précautions
1 Opération
1.1 Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter un équipement de protection individuelle (EPI), tel qu'une blouse de laboratoire et des gants jetables, lorsque vous utilisez ce produit. Ce produit est destiné UNIQUEMENT à la recherche !
1.2 Décongeler les composants à température ambiante. Bien mélanger en retournant plusieurs fois le mélange, essorer brièvement et placer sur de la glace pour utilisation.
1.3 Il est recommandé d'effectuer chaque étape de réaction dans un thermocycleur avec un couvercle chauffant. Le thermocycleur doit être préchauffé à la température définie avant utilisation.
1.4 Des fournitures exemptes de contamination par la RNase et un nettoyage régulier de la zone expérimentale sont nécessaires.
1.5 Des opérations incorrectes peuvent très probablement provoquer des contaminations par aérosols, affectant la précision du résultat. Il est recommandé d'isoler physiquement les zones de mélange de réaction PCR et les zones d'essai de purification des produits PCR. Équipé d'équipements tels que des pipettes spécialisées pour la construction de bibliothèques.
2 Ligature d'adaptateur
2.1 Les kits d'adaptateurs longs (adaptateurs à code-barres) Illumina ou MGI et les kits d'adaptateurs courts sont disponibles pour que les clients puissent choisir en fonction de leurs besoins expérimentaux.
2.2 Il a été recommandé de sélectionner des adaptateurs commerciaux de haute qualité. Si vous choisissez des adaptateurs fabriqués par vos soins, veuillez faire appel à une entreprise expérimentée dans la synthèse d'amorces NGS et souligner la nécessité d'un contrôle strict de la contamination. De plus, il est recommandé de préparer la solution de recuit d'ADN dans un banc propre et d'utiliser uniquement un type d'adaptateur à la fois pour éviter toute contamination croisée.
2.3 Veuillez décongeler les adaptateurs sur la glace ou à 4°C ; en fonctionnement à température ambiante, la température du laboratoire ne doit pas dépasser 25°C pour éviter la dénaturation des adaptateurs.
2.4 La concentration de l'adaptateur affecte directement l'efficacité de la ligature et le rendement de la bibliothèque. Le volume d'adaptateur ajouté au kit est fixé à 5 μl. Il est recommandé de diluer les adaptateurs avec un tampon 0,1×TE et les adaptateurs dilués peuvent être conservés à 4°C pendant 48 heures. Le tableau 1 répertorie la quantité d’adaptateur recommandée pour différentes quantités d’ARN d’entrée.
Tableau 1-1 Quantité d'adaptateur Illumina recommandée pour différents ARN d'entrée
| Entrée ARN total | Illumina Concentration du stock d'adaptateurs |
| 10 ng | 1 μM |
| 100 ng | 1,5 μM |
| 500 ng | 3 μM |
| ≥ 1 μg | 5 μM |
Tableau 1-2 Quantité d'adaptateur MGI® recommandée pour différents ARN d'entrée
| Entrée ARN total | MGI Concentration du stock d'adaptateurs |
| 100-499 n | 2 µM |
| 500-4000 ng | 5 μM |
*L'utilisation de l'adaptateur peut être ajustée en fonction de différents types d'échantillons d'ARN total et de la quantité d'entrée.
3 Amplification de la bibliothèque
3.1 Sur la base de l'ADN polymérase de première génération, l'ADN polymérase haute fidélité du kit a considérablement amélioré son uniformité d'amplification et ne présente aucun biais d'amplification.
3.2 Si l'adaptateur indexé (également connu sous le nom d'adaptateur long ou d'adaptateur Y large) est ligaturé à l'ADN cible, le mélange d'amorces fourni dans ce kit peut être utilisé pour l'amplification ; si un « adaptateur court » ou un « petit adaptateur Y » est utilisé pour la ligature de l'ADN, des amorces d'index sont nécessaires pour l'amplification.
3.3 Le nombre de cycles d'amplification doit être strictement contrôlé. Une amplification insuffisante peut entraîner un faible rendement de la bibliothèque. Une suramplification peut entraîner une augmentation des biais, des erreurs, des lectures dupliquées, des produits chimériques et une accumulation de mutations d'expansion. Le tableau 2 répertorie les nombres de cycles recommandés pour l'amplification par PCR.
Tableau 2 Nombre de cycles recommandé pour générer une bibliothèque d'ARN*
| Entrée ARN total | Nombre de cycles | |
| Non-échoué | Échoué | |
| 10 ng | 15 | 15 |
| 100 ng | 14 | 14 |
| 500 ng | 12 | 13 |
| 1 μg | 11 | 12 |
Remarque : *Le rendement de la bibliothèque n'est pas uniquement lié à la quantité d'entrée et au nombre de cycles d'amplification mais aussi affectée par la qualité des échantillons, les conditions de fragmentation et les conditions de tri. Dans le processus de construction de la bibliothèque, choisissez les conditions les plus appropriées en fonction de la situation réelle.
4 Nettoyage de l'ADN à base de billes et sélection de la taille
4.1 Le processus de construction d'une bibliothèque comprend plusieurs étapes qui nécessitent l'utilisation de billes magnétiques pour la purification de l'ADN. Nous recommandons les billes magnétiques de sélection d'ADN Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) ou les billes magnétiques AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) pour la purification de l'ADN et la sélection de la taille.
4.2 Les billes magnétiques doivent être équilibrées à température ambiante avant utilisation, sinon le rendement diminuera et l'effet de sélection de taille sera affecté.
4.3 Les billes magnétiques doivent être bien mélangées par vortex ou pipetage avant utilisation.
4.4 N'aspirez pas les billes lors du transfert du surnageant, même des traces de billes peuvent avoir un impact sur les réactions suivantes.
4.5 L'éthanol à 80 % doit être fraîchement préparé, sinon cela affectera l'efficacité de la récupération.
4.6 Les billes magnétiques doivent être séchées à température ambiante avant l'élution du produit. Une sécheresse insuffisante peut facilement entraîner une altération des réactions ultérieures par l'éthanol résiduel ; une sécheresse excessive peut provoquer la fissuration des billes magnétiques et réduire le rendement de purification. Normalement, un séchage à température ambiante pendant 3 à 5 minutes suffit pour permettre aux billes de sécher complètement.
4.7 Si nécessaire, les échantillons d'ADN purifiés ou sélectionnés par taille élués dans un tampon TE peuvent être conservés à 4°C pendant 1 à 2 semaines ou à -20°C pendant un mois.
5 Analyse de la qualité de la bibliothèque
5.1 Normalement, la qualité de la bibliothèque construite peut être évaluée par la distribution des longueurs et la détection de la concentration.
5.2 Détection de concentration de bibliothèque : méthodes basées sur des colorants fluorescents d'ADN double brin, tels que Qubit®, PicoGreen®, etc. ; quantification absolue basée sur la qPCR.
5.3 Les méthodes basées sur la détection spectrale, telles que NanoDrop®, etc., ne sont pas applicables à la détection de concentration de bibliothèque.
5.4 La qPCR est recommandée pour la détection de la concentration de la bibliothèque : avec Qubit®, PicoGreen® et d'autres méthodes basées sur des colorants fluorescents d'ADN double brin, il n'est pas possible de distinguer efficacement les produits liés aux adaptateurs à une extrémité, les produits non liés aux adaptateurs aux deux extrémités et les autres produits double brin incomplets. La quantification absolue de la qPCR est basée sur le principe de l'amplification PCR, qui quantifie uniquement la bibliothèque complète de l'adaptateur aux deux extrémités de l'échantillon (la bibliothèque qui peut être séquencée), en excluant l'interférence des bibliothèques non séquencées qui ne sont pas liées à l'adaptateur aux extrémités simple ou double.
5.5 La détection de la distribution de longueur de bibliothèque peut être effectuée par Agilent Bioanalyzer 2100 et d'autres équipements basés sur le principe de l'électrophorèse capillaire ou de la microfluidique.
Documents:
12308ES-Kit de préparation de bibliothèque d'ARN bimode Hieff NGS™ Ultima-Ver.EN20230327.pdf
Citations et références :
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