Description
Hieff NGSMT Le kit de préparation de bibliothèque d'ARN EvoMax (dUTP) est un prémélangé, actinomycine D libre et brin spécifique total Bibliothèque de séquençage d'ARN préparation Kit compatible avec les plateformes Illumina et MGI. Ce produit est disponible en deux types : tube ou kit d'étanchéité, et ce kit est plus pratique que ce soit par un dispositif automatisé de manipulation de liquide ou manipulation manuelle Le kit contient des réactifs de fragmentation d'ARN, des réactifs de transcription inverse, des réactifs de synthèse ds-ADNc spécifiques à un brin et des réactifs d'amplification de bibliothèque. Il peut être associé au kit de purification d'ARNm ou au kit d'élimination d'ARNr pour effectuer des recherches sur l'ARNm ou l'ARNnc. Ce produit optimise le module de transcription inverse pour obtenir une bibliothèque à haute spécificité de chaîne sans actinomycine D, ce qui garantit davantage la sécurité des expérimentateurs. Tous les réactifs ont été soumis à un contrôle qualité strict et à une validation fonctionnelle pour maximiser la stabilité et la répétabilité de la bibliothèque préparation.
Caractéristiques
| N° de cat. | 12340ES24/12340ES96/12340ES97/12340ES98 |
| Taille | 24 T / 96 T / 96 T (automatisation) / 96 T (plaque) |
Composants
| Composants N° | Nom | 12340ES24 | 12340ES96 | 12340ES97 (automatisation) | 12340ES98 (Plaque )** |
| 12340-A | Tampon Frag/Prime | 450 μL | 2×900 μL | 2×1064 μL | 8×266 μL |
| 12340-B | 1er Module de Réaction 2.0 | 192 μL | 768 μL | 960 μL | 8×120 μL |
| 12340-C | 2e module de réaction (dUTP) | 840 μL | 3×1120 μL | 3×1280 μL | 8×480 μL |
| 12340-D | Module de réaction de ligature | 840 μL | 3×1120 μL | 3×1280 μL | 8×480 μL |
| 12340-F | 2×Super Canace® II Mix Haute Fidélité | 600 μL | 2×1200 μL | 2×1360 μL | 8×340 μL |
| * | Mélange d'apprêt* | / | / | / | / |
Remarque : * La notation indique que le composant n'est pas inclus dans le kit. Un mélange d'apprêt est nécessaire si les adaptateurs complets sont utilisés, sinon il n'est pas inclus.'t. Ce kit est compatible avec les plateformes Illumina et MGI, mais nécessite un mélange d'amorces supplémentaire (Cat # 13334 Mélange d'amorces pour MGIMT et Cat # 13335 Primer Mix pour Illumina®) pour la plate-forme Illumina® ou MGI si les adaptateurs complets sont utilisés.
Chiffre
La disposition du groupe de réactifs de la plaque.
Figure 1 : disposition des réactifs du kit de bibliothèque de plaques d'étanchéité
Figure 2. Composants simplifiés de Kit de préparation de bibliothèque d'ARN EvoMax.
Stockage
Ce produit doit être conservé entre -25 et -15 ℃ pendant 1 années.
Instructions
1. La quantité recommandée à ajouter dans un système de 20 μL est 0,1-1 unités (U), et la quantité d'entrée peut être ajustée en fonction des résultats réels.
2. Selon les exigences de l'expérience, la concentration finale de dUTP peut être ajustée entre 0,2 et 0,6 mM, et 0,2 mM de dTTP peut être ajouté de manière sélective.
3. Le temps de réaction à 25~37℃ peut être ajusté dans un délai de 5 à 10 minutes selon les besoins expérimentaux.
Remarques
1. Opération
1) Veuillez travailler avec des blouses de laboratoire et des gants jetables，pour votre sécurité.
2) Décongeler les composants à température ambiante. Bien mélanger en retournant plusieurs fois le mélange, essorer brièvement et placer sur de la glace pour utilisation.
3) Il est recommandé d'effectuer chaque étape de réaction dans un thermocycleur avec un couvercle chauffant. Le thermocycleur doit être préchauffé à la température définie avant utilisation.
4) Des fournitures exemptes de contamination par la RNase et un nettoyage régulier de la zone expérimentale sont nécessaires. RNAZap de ThermoFisherMT Un spray d'élimination des acides nucléiques à haute efficacité a été recommandé pour éliminer la contamination par l'ARNase.
5) Des opérations incorrectes peuvent très probablement entraîner des contaminations par aérosols, affectant la précision des résultats. L'isolement physique obligatoire des zones de mélange de réaction PCR et des zones d'essai de purification des produits PCR est recommandé. Equipé de matériel tel que des pipettes spécialisées pour la construction de bibliothèques.
6) Ce réactif est à usage unique. Toute utilisation multiple est strictement interdite.
7) Ce produit est destiné à la recherche uniquement.
2. Ligature de l'adaptateur
1) Des kits d'adaptateurs longs (adaptateurs à code-barres) Illumina ou MGI et des kits d'adaptateurs courts sont disponibles pour que les clients puissent choisir en fonction de leurs besoins expérimentaux.
2) Il a été recommandé de sélectionner des adaptateurs commerciaux de haute qualité. Si vous choisissez des adaptateurs fabriqués par vos soins, veuillez faire appel à une entreprise expérimentée dans la synthèse d'amorces NGS et notez la nécessité d'un contrôle strict de la contamination. De plus, il est recommandé de préparer la solution de recuit d'ADN dans un banc propre et d'utiliser uniquement un type d'adaptateur à la fois pour éviter toute contamination croisée.
3) Veuillez décongeler les adaptateurs sur la glace ou à 4°C ; en fonctionnement à température ambiante, la température du laboratoire ne doit pas dépasser 25°C pour éviter la dénaturation des adaptateurs.
4) La concentration de l’adaptateur affecte directement l’efficacité de la ligature et le rendement de la bibliothèque. Le volume d'adaptateur ajouté au kit est fixé à 5 μl. Il est recommandé de diluer les adaptateurs avec un tampon 0,1×TE et les adaptateurs dilués peuvent être conservés à 4°C pendant 48 heures. Tableau 1 répertorie la quantité d’adaptateur recommandée pour différentes quantités d’ARN d’entrée.
Tableau 1-1 Quantité d'adaptateur Illumina recommandée pour différents ARN d'entrée
| Entrée ARN total | Concentration du stock d'adaptateurs Illumina® |
| 10 ng | 1 μM |
| 100 ng | 1,5 μM |
| 500 ng | 3 μM |
| ≥ 1 μg | 5 μM |
Tableau 1-2 Quantité d'adaptateur MGI recommandée pour différents ARN d'entrée
| Entrée ARN total | Concentration de stock d'adaptateurs MGI® |
| 10 à 99 ng | 1 μM |
| 100 à 499 ng | 2 μM |
| 500 à 4 000 ng | 5 μM |
* L'utilisation de l'adaptateur peut être ajustée en fonction des différents types d'échantillons d'ARN totaux et de la quantité d'entrée
3.Amplification de la bibliothèque
1) Sur la base de l'ADN polymérase de première génération, l'ADN polymérase haute fidélité du kit a considérablement amélioré son uniformité d'amplification et ne présente aucun biais d'amplification.
2) Le nombre de cycles d'amplification doit être strictement contrôlé. Une amplification insuffisante peut entraîner un faible rendement de la bibliothèque. Une suramplification peut entraîner une augmentation des biais, des erreurs, des lectures dupliquées, des produits chimériques et une accumulation de mutations d'expansion. Le tableau 2 répertorie les nombres de cycles recommandés pour l’amplification par PCR.
3) Le nombre de cycles recommandé dans le tableau 2 peut répondre à la grande majorité des exigences de préparation de la bibliothèque. Si votre échantillon est de mauvaise qualité (comme les échantillons FFPE avec une dégradation sévère), le nombre de cycles peut être augmenté de manière appropriée, en fonction de la situation réelle. Veuillez noter que l'ARNm varie selon les espèces et les tissus, le nombre de cycles d'amplification doit être ajusté.
Tableau 2 Volume total d'ARN d'entrée et cycles d'amplification recommandés Tableau *
| Entrée ARN total | Nombre de cycles |
| 10 ng | 16 |
| 100 ng | 14 |
| 500 ng | 12 |
| 1 μg | 11 |
[Remarque] : *Le rendement de la bibliothèque n'est pas seulement lié à la quantité d'entrée et au nombre de cycles d'amplification, mais également affecté par la qualité des échantillons, les conditions de fragmentation et les conditions de tri. Lors du processus de construction de la bibliothèque, choisissez les conditions les plus appropriées en fonction de la situation réelle.
4. Nettoyage de l'ADN à base de billes et sélection de la taille
1) Le processus de construction d'une bibliothèque comprend plusieurs étapes qui nécessitent la purification de l'ADN par des billes magnétiques. Nous recommandons les billes de sélection d'ADN Hieff NGS™ (Yeasen Cat#12601) ou les billes magnétiques AMPure® XP (Beckman Cat#A63880) pour la purification de l'ADN et la sélection de la taille.
2) La bille magnétique doit être équilibrée à température ambiante avant utilisation, sinon le rendement diminuera et l'effet de sélection de la taille sera affecté.
3) Les billes magnétiques doivent être bien mélangées par vortex ou pipetage avant utilisation.
4) N'aspirez pas les billes lors du transfert du surnageant, même des traces de billes peuvent avoir un impact sur les réactions suivantes.
5) L'éthanol à 80 % doit être fraîchement préparé, sinon cela affectera l'efficacité de la récupération.
6) Les billes magnétiques doivent être séchées à température ambiante avant l'élution du produit. Une sécheresse insuffisante peut facilement entraîner un effet résiduel de l'éthanol sur les réactions ultérieures ; une sécheresse excessive peut provoquer la fissuration des billes magnétiques et réduire le rendement de purification. Normalement, un séchage à température ambiante pendant 3 à 5 minutes suffit pour permettre aux billes de sécher complètement.
7) Si nécessaire, les échantillons d'ADN purifiés ou sélectionnés par taille élués dans un tampon TE peuvent être stockés à 4°C pendant 1 à 2 semaines ou à -20°C pendant un mois.
5.Analyse de la qualité de la bibliothèque
En général, la qualité de la bibliothèque construite peut être évaluée par détection de concentration et détection de distribution de longueur.
6. Autres documents
1) Kit d'enrichissement d'ARNm : Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat # 12629).
2) Kit d'élimination d'ARNr : kit d'élimination d'ARNr humain Hieff NGS® MaxUp (ARNr et ITS/ETS) (Yeasen Cat # 12257) ou autre kit d'élimination d'ARNr.
3) Purification de l'ARN des billes magnétiques : Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat # 12602) ou autres produits équivalents.
4) Billes magnétiques purifiées d'ADN : Billes de sélection d'ADN Hieff NGS® (Yeasen Cat # 12601) ou Billes AMPure® XP (A63880) ou autres produits équivalents.
5) Contrôle qualité de l'ARN : Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano / Pico Chip ou autres produits équivalents.
6) Adaptateurs : Adaptateur complet pour utilisation Illumina® (Cat # 13519-13520 ou autre équivalent) ou Adaptateur complet pour utilisation MGI® (Cat # 13360-13362 ou autre équivalent).
7. Contrôle de la qualité de la bibliothèque
Puce Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip / High Sensitivity Chip ou autres produits équivalents ; réactifs de quantification de bibliothèque.
8. Autres matériaux
Éthanol anhydre, eau ultrapure stérile, tête de pistolet à faible adsorption, tube PCR, cadre magnétique, instrument PCR, etc.
Organigramme
Figure 1 : Processus de création d'une bibliothèque d'ARN
Préparation de la bibliothèque d'ARN pour différents échantillons FFPE de qualité
Pour les ARN FFPE gravement dégradés (DV 200 < 50 %) et les échantillons à faible entrée, nous recommandons un protocole de double purification après la ligature de l'adaptateur pour réduire la perte de bibliothèque.
Diagrammes de pics d'échantillons FFPE de différentes qualités
Paiement et sécurité
Vos informations de paiement sont traitées en toute sécurité. Nous ne stockons pas les détails de la carte de crédit ni accès aux informations de votre carte de crédit.
Enquête
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FAQ
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