Description du produit

Le kit Hieff NGS™ mRNA Isolation Master est un kit de billes magnétiques spécialement conçu pour la purification de l'ARNm. Les billes de capture d'ARNm sont des microsphères paramagnétiques de la taille d'un micromètre couplées à des queues d'oligo dT (poly A), qui peuvent être utilisées pour isoler l'ARNm de 10 ng à 4 μg d'ARN complet en se liant à l'ARNm avec des queues poly A.

Caractéristiques

Composants

Stockage

Le produit doit être conservé entre 2 et 8 ℃ pendant un an et éviter le gel.

Instructions

1. Matériel requis non inclus

Support magnétique, tubes PCR sans nucléase

2. Opération

1) Équilibrer les billes de capture d'ARNm à température ambiante (~ 30 min).

2) Diluer 10 ng – 4 μg d’ARN total à 50 μL avec de l’eau sans nucléase dans un tube PCR sans nucléase, placer-le sur de la glace.

3) Mélangez les billes magnétiques en les retournant ou en les vortexant. Ajoutez 50 μL de billes magnétiques dans 50 μL d'échantillon d'ARN total et pipetez 6 fois pour bien mélanger. Centrifugez brièvement jusqu'au fond du tube.

4) Incuber le mélange de billes magnétiques et d'ARN dans un thermocycleur et exécuter le programme suivant : 65°C, 5 min ; 25°C, 5 min ; 25°C, maintien.

5) Placer le tube sur un support magnétique étagère pendant 5 minutes pour séparer l'ARNm de l'ARN total. Retirez soigneusement le surnageant.

6) Retirez le tube du support magnétique étagère et resuspendez les billes magnétiques avec 200 μL de tampon de lavage de billes. Pipetez le volume entier de haut en bas 6 fois pour bien mélanger. Placez le tube sur un support magnétique étagère pendant 5 min et retirez soigneusement le surnageant.

7) Répétez l’étape 6.

8) Retirez le tube du support magnétique étagère. Ajoutez 50 μL de tampon Tris pour remettre en suspension les billes magnétiques et pipetez 6 fois pour bien mélanger.

9) Placez l'échantillon dans un thermocycleur et exécutez le programme suivant pour éluer l'ARNm : 80 °C, 2 min ; 25 °C, maintien.

10) Retirez l'échantillon du thermocycleur. Ajoutez 50 µl de tampon de liaison de billes et pipetez à plusieurs reprises 6 fois pour bien mélanger.

11) Incuber à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre à l’ARNm de se lier aux billes magnétiques.

12) Placez le tube sur le support magnétique Laissez reposer 5 minutes et retirez délicatement le surnageant.

[Remarque] : Une pipette de 10 μL est nécessaire pour aspirer le liquide restant.

13) Retirez le tube du support magnétique étagère, resuspendre les billes magnétiques avec 200 μL de tampon de lavage de billes, pipeter à plusieurs reprises 6 fois pour bien mélanger. Placer le tube sur le support magnétique étagère à température ambiante pendant 5 minutes. Retirer et jeter tout le surnageant.

14) Élution finale de l'ARNm

Schéma A : Pour la réaction de transcription de réserve

Retirer le tube du magnétique étagère. Ajouter 12 μL d'eau sans nucléase et pipeter à plusieurs reprises 6 fois pour bien mélanger. Placer le tube dans le thermocycleur et exécuter le programme suivant : 80°C, 2 min. Placez ensuite le tube sur le support magnétique. étagère Laissez immédiatement reposer à température ambiante pendant 5 min. Une fois la solution clarifiée, aspirez soigneusement 10 μL de surnageant dans un autre nouveau tube PCR sans nucléase.

Schéma B: Pour l'ARN préparation de la bibliothèque

Ajoutez le volume approprié de tampon Frag/Primer conformément aux instructions du kit correspondant pour la construction de la bibliothèque.

Note

1. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter des blouses de laboratoire et des gants jetables pour l'opération.
2. À usage de recherche uniquement.
3. Assurez-vous de réchauffer à température ambiante et de bien mélanger avant d'utiliser les billes magnétiques, sinon l'efficacité de récupération des échantillons peut être affectée.
4. L’opération doit être strictement exempte de contamination par l’ARNase et les acides nucléiques.
5. Lorsque ce produit est utilisé avec d'autres réactifs, veuillez suivre les instructions expérimentales spécifiques pour son utilisation.
6. Pour obtenir de bons résultats de purification, vous devez avoir une bonne intégrité de l’ARN total et garantir une valeur RIN > 7,0.