Sonde de déplétion de l'ARNm de la globine (humaine) est conçu pour éliminer l'ARNm de la globine humaine. Il peut éliminer efficacement l'ARNm de la globine des adultes, des nourrissons et des embryonsNic sources, notamment HBA1/2, HBB, HBD, HBM, HBG1/2, HBE1, HBQ1 et HBZ. Ce produit est utilisé avec Hieff NGS^MT Kit de déplétion d'ARNr MaxUp (humain/souris/rat) (Yeasen n° 12253) pour éliminer efficacement l'ARNr et l'ARNm de la globine de l'ARN total. Ce kit convient aux échantillons d'ARN intacts et dégradés. Les échantillons d'ARN après élimination de l'ARNr et de l'ARNm de la globine peuvent être utilisés pour l'analyse de séquençage à haut débit de l'ARNm et de l'ARN non codant, ce qui améliore considérablement la proportion de données valides dans les résultats de séquençage, ainsi que la synthèse d'ADNc ou d'autres applications en aval.

Application du produit

Convient pour 100 ng ~ 1 μg d'échantillons d'ARN total humain, ressource sanguine de souris et de rat, et pour des échantillons d'ARN intacts ou partiellement dégradés.

Composants du produit

Expédition et stockage

Tous les composants sont expédiés avec de la glace sèche et peuvent être stockés à -20°C pendant un an.

Chiffre

Au total, 500 ng et 100 ng d'ARN total du sang humain ont subi respectivement une élimination de l'ARNr et une élimination combinée de l'ARNr et de la globine. Après la construction de la bibliothèque et le séquençage, le contenu de l'ARNm de la globine a été comparé.

Précautions

1. Veuillez utiliser des consommables exempts de contamination par la RNase et nettoyer régulièrement la zone expérimentale. Il est recommandé d'utiliser le RNAZap de ThermoFisher^MT Spray d'élimination des acides nucléiques à haute efficacité pour éliminer la contamination par l'ARNase.

2. L'échantillon d'ARN doit être exempt de contamination par l'ADN génomique. Si de l'ADN génomique reste présent dans l'échantillon, il doit être digéré par la DNase I et purifié avant utilisation.

3. Le volume d'entrée maximal de l'échantillon d'ARN est de 10 μL. Si le volume de l'échantillon est important, il peut être concentré au préalable.

4. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter des blouses de laboratoire et des gants jetables pour l'opération.

5. Réservé à la recherche uniquement !

Instructions

1. Hybridation de sonde à l'ARN

1.1 Diluer 10 ng–1 μg d'ARN total avec de l'eau sans nucléase jusqu'à un volume final de 10 μL dans un tube PCR. Conserver l'ARN sur la glace.

1.2 Assembler la réaction d'hybridation ARN/sonde suivante sur la glace selon le tableau 1.

Tableau 1 Réaction d'hybridation ARN/sonde

1.3 Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas au moins 10 fois. Centrifuger brièvement le tube dans une microcentrifugeuse pour recueillir le liquide sur les parois du tube.

1.4 Placez le tube dans un thermocycleur et exécutez le programme suivant dans le tableau 2 avec le couvercle chauffant réglé à 105 °C.

Tableau 2 Programme de réaction d'hybridation ARN/sonde

2. Digestion de la RNase H

2.1 Assemblez la réaction de digestion de la RNase H suivante sur la glace selon le tableau 3.

Tableau 3 Réaction de digestion par la RNase H

2.2 Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas au moins 10 fois. Centrifuger brièvement le tube dans une microcentrifugeuse pour recueillir le liquide sur les parois du tube.

2.3 Placez le tube dans un thermocycleur et exécutez le programme suivant : couvercle 50°C ; 37°C, 30 minutes ; 4°C, maintenez.

3. ADNase je Digestion

3.1 Assemblez la réaction de digestion de DNase I suivante sur glace conformément au tableau 4.

Tableau 4 Réaction de digestion par la DNase Ⅰ

3.2 Bien mélanger en pipetant doucement de haut en bas au moins 10 fois. Centrifuger brièvement le tube dans une microcentrifugeuse pour recueillir le liquide sur les parois du tube.

3.3 Placez le tube dans un thermocycleur et exécutez le programme suivant : couvercle retiré ; 37°C, 30 minutes ; 4°C, maintenez.

4. Purification de l'ARN

4.1 Équilibrer le NGS de Hieff^MTNettoyant ARN (Cat#12602) à température ambiante et resuspendez soigneusement les billes en les vortexant avant utilisation.

4.2 Ajouter 110 µL (2,2×) Ajoutez les billes à la solution d’ARN de l’étape 3.3 et mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas au moins 10 fois.

4.3 Incuber à température ambiante pendant 5 minutes pour lier l’ARN aux billes.

4.4 Placer le tube sur un support magnétique pour séparer les billes du surnageant. Lorsque la solution est claire (environ 3 minutes), jetez le surnageant. Veillez à ne pas toucher les billes avec les pointes de la pipette.

4.5 Maintenez le tube sur le support magnétique. Ajoutez 200 µL d'éthanol à 80 % fraîchement préparé dans le tube. Incubez à température ambiante pendant 30 secondes, puis jetez le surnageant. Veillez à ne pas toucher les billes avec les embouts de la pipette.

4.6 Répétez l’étape 4.5 une fois pour un total de deux lavages.

4.7 Éliminer l'éthanol résiduel avec 10 µL - pointes de pipettes. Gardez le tube sur le support magnétique et laissez sécher les billes à l'air libre jusqu'à 5 minutes avec le couvercle ouvert.

4.8 Retirez le tube du support magnétique. Éluez l'ARN des billes en ajoutant 11 μL d'eau sans nucléase. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas au moins 10 fois et faites tourner brièvement le tube.

4.9 Incuber 5 minutes à température ambiante. Placer le tube sur le support magnétique jusqu'à ce que la solution soit claire (~ 3 minutes).

4.10 Transférer 10 µL du surnageant dans un tube sans nucléase.

Remarque : si vous devez vous arrêter à ce stade, les échantillons peuvent être stockés à –80 °C.