Hifair™ Kit de sonde RT-qPCR multiplex en une étape V (UDG Plus) est un kit de PCR quantitative multiplex basé sur l'ARN comme matrice. Au cours de l'expérience, la transcription inverse et la PCR quantitative ont été réalisées dans le même tube, ce qui a simplifié l'opération expérimentale et réduit le risque de contamination.

Dans ce kit, le premier brin d'ADNc a été synthétisé efficacement par Hifair résistant à la chaleur^MT V Reverse Transcriptase et amplifiée quantitativement par UNICON^MT ADN polymérase HotStart Taq. Le kit contient principalement un tampon MP optimisé, un mélange d'enzymes, etc. La solution tampon contient déjà du Mg²⁺ et dNTP. De plus, les facteurs qui peuvent inhiber efficacement l'amplification PCR non spécifique et améliorer l'efficacité d'amplification de multiples réactions qPCR sont ajoutés, ce qui peut garantir l'efficacité de l'amplification et réaliser jusqu'à plusieurs réactions d'amplification. Le système dUTP/UDG a été ajouté pour prévenir efficacement le risque de contamination par aérosol.

Caractéristiques

Haute sensibilité：Le système tampon soigneusement optimisé améliore la sensibilité de détection des modèles à faible concentration jusqu'à 250 copies/mL；

Super stabilité : le produit a passé avec succès les tests de stabilité en temps réel pendant 18 mois.

Système antipollution dUP/UDG：Le système antipollution dUTP/UDG est introduit pour dégrader efficacement la pollution par aérosol des produits, réduire les faux positifs et garantir des résultats authentiques；

Prise en charge du programme rapide : compatible avec le programme rapide, 40 minutes peuvent produire des résultats ;

Composants

Note: 1) 2×Hifair^MT Tampon V MP est l'abréviation de Hifair^MT Tampon de sonde RT-qPCR multiplex en une étape V, qui comprend les dNTP, les dUTP, le Mg2+, stabilisateurs, activateurs et plus encore.

2) Hifair^MT Mélange d'enzymes V contient principalement Hifair résistant à la chaleur^MT V transcriptase inverse, UNICONMT Polymères d'ADN HotStart Taq et Base de données UDG.

Stockage

Til produit devrait être stocké à -25°C~-15°C pour 18 mois.

Instructions

Composition de la réaction

Note：Assurez-vous de bien mélanger avant utilisation, évitez les bulles excessives causées par des vibrations violentes.

a) Apprêt/Sonde concentration: Apprêt mélange comprenant un apprêt multiplex, selon la situation, la concentration optimale de l'amorce peut être comprise entre 0,1 et 1,0 μM.Mélange de sondes comprenant un groupe fluorescent de différence de marquage de sonde multiplex, selon la situation, la concentration optimale de sonde peut être comprise entre 0,05 et 0.5 µM.

c) Dilution du modèle : la qPCR est très sensible et il est recommandé de diluer le modèle. La valeur Ct du contrôle est comprise entre 20 et 35.

d) Préparation du système : désengorger avec l'élément filtrant. Éviter la contamination croisée et la contamination par aérosol.

Protocole de cyclisme optimisé

Note：a) Rtranscription inverse : La température peut être sélectionnée à 42°C ou 50°C pendant 10 à 15 minutes.

b) Réaction d'amplification : La température est ajustée en fonction de la valeur Tm des amorces conçues.

c) Acquisition du signal de fluorescence:Veuillez définir la procédure expérimentale conformément aux exigences du manuel de l'instrument.

3. Application équipement

Équipement avec Rox：ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT rapide, StepOne™, StepOne Plus™

Équipement avec faible Rox：ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 et 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex

Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™

Équipement sans Rox：

Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™

Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000

Roche Sciences Appliquées LightCycler® 480, LightCycler® 2.0, Lightcycler® 96

Thermo Cycleur scientifique PikoReal ; Céphéide SmartCycler®; Illumina Éco qPCR

Remarques

Veuillez porter l'EPI nécessaire, comme une blouse de laboratoire et des gants, pour assurer votre santé et votre sécurité！

Veuillez utiliser des consommables sans RNase pour l'expérience.

Test de sensibilité

Les 13650 conservés à -20°C pendant 18 mois (groupe expérimental) et ceux en cours de conservation (groupe témoin) ont été testés simultanément pour la dilution en gradient (500 copies/ml, 250 copies/ml) du pseudovirus SARS-CoV-2, ciblant le gène ORF et le gène N. Huit puits répliqués ont été testés pour chaque concentration, avec un taux de détection de 100 %. De plus, il n'y avait pas de différences significatives dans les formes de pics de courbe d'amplification et les valeurs de Ct.

Test de stabilité en temps réel

Les 13650 ont été conservés à -20°C pendant 18 mois et ceux qui sont dans leur durée de conservation. Les deux groupes ont été testés simultanément pour le gène ORF du pseudovirus SARS-CoV-2 et le gène N à une concentration de 1000 copies/ml avec 20 puits répliqués. Le taux de détection pour les deux était de 100 %, et il n'y avait pas de différences significatives dans la forme des courbes d'amplification ou les valeurs Ct.

Figure 1. Réd: 13650 dans leur durée de conservation；bleu：13650 conservé à -20°C pendant 18 mois。

Performances stables après des cycles répétés de gel-dégel

En soumettant le réactif 13650 à 30 et 50 cycles de congélation-décongélation en utilisant de la glace sèche, en plus des réactifs stockés normalement à -20°C, et en testant simultanément le gène ORF du pseudovirus SARS-CoV-2, les résultats ont indiqué que les performances du réactif 13650 n'étaient pas affectées après 50 cycles de congélation-décongélation.

Figure 2. Rouge : 13650 stocké normalement à -20°C ; Violet：13650 à 30 cycles de gel-dégel；Vert：13650 à 50 cycles de gel-dégel.

Compatible avec les protocoles standard et rapides

En utilisant 13650ES, le gène ORF et le gène N du pseudovirus SARS-CoV-2 ont été détectés dans le même système de réaction avec les protocoles standard et rapide. Les résultats ont montré que dans un système 4-plex, il n'y avait aucune différence dans les formes de pic de la courbe d'amplification et les valeurs Ct entre les deux protocoles.

Documents:

Manuels