L'amplification non spécifique de l'ADN polymérase Taq est un problème courant dans les expériences de PCR, qui affecte directement l'interprétation des résultats de détection et peut entraîner une diminution de la sensibilité d'amplification, voire une réduction du rendement du fragment cible. L'utilisation de modificateurs d'enzymes pour sceller le centre actif de l'ADN polymérase Taq à température ambiante, inhibant ainsi l'activité ADN polymérase de l'enzyme Taq à température ambiante, est actuellement la méthode la plus efficace pour supprimer l'amplification non spécifique. Les anticorps à double scellement développés par Yisheng scellent non seulement l'activité polymérase de l'ADN polymérase Taq, mais scellent également simultanément l'activité exonucléase de l'ADN polymérase Taq. Cette double approche empêche efficacement l'amplification non spécifique causée par un mauvais appariement ou des dimères d'amorces et empêche également la génération de signaux non spécifiques dus à la dégradation du matériau, améliorant ainsi doublement la spécificité du réactif. Cela permet aux réactifs de détection de supporter facilement le transport ou l'utilisation à température ambiante.

1.Spécificité d’amplification ultra-élevée : l’anticorps à double étanchéité peut sceller simultanément les activités de polymérase et d’exonucléase, évitant ainsi efficacement l’amplification non spécifique et améliorant la spécificité.

2.Sensibilité de détection exceptionnelle : la formulation à démarrage à chaud assure une détection efficace des gènes à faible abondance, offrant une sensibilité plus élevée.

3.Stabilité exceptionnelle du produit : performances stables lorsqu'il est placé à 37 °C pendant 5 jours ou à 4 °C pendant 10 jours.

4.Stabilité de la ligne de base et bonne linéarité : résolution du problème de dérive de la ligne de base, ce qui se traduit par une excellente linéarité.

5.Libération rapide de l’activité enzymatique : plus de 95 % de l’activité enzymatique peuvent être libérés en chauffant à 95 °C pendant 20 secondes.

6.Large applicabilité des enzymes : convient aux enzymes Taq de type sauvage et mutantes, chaque mg d'anticorps étant capable de sceller 4 à 10 KU d'enzyme Taq.

1 Blocage de l'activité exonucléase de l'ADN polymérase Taq

Des sondes d'amorce synthétiques ont été respectivement incorporées dans les mélanges réactionnels de l'ADN polymérase Taq qui ont été soit descellés, soit scellés avec des anticorps à double fermeture, et les réactions ont été menées à 40°C. Les signaux de fluorescence des deux ont été détectés, et il a été découvert que les anticorps à double fermeture peuvent sceller efficacement l'activité exonucléase de l'ADN polymérase Taq.

Figure 2. Détection de l’efficacité de scellement de l’activité anticorps-endonucléase à double scellement.

02 Vérification de la sensibilité de détection

En utilisant respectivement l'anticorps doublement scellé de Yeasen et l'anticorps de T Company pour sceller l'enzyme Taq, suivi de la détection d'échantillons positifs grâce à la technologie ARMS-PCR, il a été constaté que l'enzyme Taq scellée par l'anticorps doublement scellé de Yeasen était précise dans l'amplification ARMS-PCR avec une sensibilité plus élevée.

Rouge : anticorps YEASEN + Taq; Bleu : anticorps fournisseur A + Taq.

Figure 3. Courbe d'amplification de l'ARMS-PCR.

03 Vérification de la stabilité (4°C pendant 10 jours, 37°C pendant 5 jours).

En utilisant des anticorps fermés traditionnels et des anticorps doublement fermés pour bloquer respectivement l'ADN polymérase Taq, la polymérase est ensuite formulée dans une solution de prémélange complète contenant des amorces et des sondes. Cette solution est laissée à 4°C pendant 10 jours ou à 37°C pendant 1, 3 et 5 jours, puis utilisée pour amplifier 10 000 copies du plasmide ASF. Il a été observé qu'il n'y avait pas de changements significatifs dans les courbes d'amplification et les valeurs Ct.

Figure 4. Courbes d'amplification de 10 000 copies du plasmide ASF après blocage de la Taq polymérase avec un anticorps bloquant traditionnel (A) et un anticorps doublement bloqué (B), amplifiées par le système de qPCR.

04 Détection de la ligne de base

Dans certaines conditions où des amorces spécifiques sont utilisées en conjonction avec des tampons et des instruments particuliers, un phénomène connu sous le nom de dérive de la ligne de base peut se produire. Cependant, l'utilisation d'anticorps à double fermeture peut résoudre efficacement le problème de la dérive de la ligne de base, facilitant ainsi une ligne de base plus stable.

Figure 5. Courbes d'amplification du gène N du SARS-CoV-2 (A) et du gène ACT (B) dans l'analyse qPCR.

05 Vérification de la linéarité

Le mélange réactionnel scellé avec des anticorps à double fermeture a été utilisé pour amplifier 100 000, 10 000, 1 000 et 100 copies du plasmide double ASFV/ACT afin de générer une courbe standard. Comme le montre la figure 7, les deux présentent une bonne linéarité.

Figure 6. Graphiques de courbes standard pour les gènes ASFV et ACT générés à l'aide d'un mélange réactionnel à double bloc.

06 Dosage de la libération de l'activité enzymatique

En utilisant les anticorps à double fermeture (Cat#31303) de Yeasen pour sceller l'enzyme Taq et en le soumettant à un choc thermique à 95°C pendant 20 secondes, l'activité enzymatique a été détectée. On peut observer qu'après un choc thermique de 20 secondes à 95°C, le 31303 peut libérer plus de 95 % de l'activité enzymatique, ce qui est comparable aux anticorps de la société T.

Tableau 1. Choc thermique à 95°C pendant 20 secondes de l'enzyme.

07 Détection multiplexée de polymérase Taq

Les anticorps à double fermeture de Yeasen (Cat#31303) ont été utilisés pour sceller trois types de polymérases Taq (type sauvage + deux types mutants), avec un rapport de scellage de 1 μg à 5 U, et les valeurs de fluorescence et l'efficacité de scellage ont été mesurées. Il a été constaté que pour différents types de polymérases Taq, les anticorps à double fermeture de Yeasen (Cat#31303) présentaient de bons effets de scellage.

Tableau 2. Efficacité bloquée de différents types de Taq polymérase.