Description
Le kit de comptage cellulaire 8 (CCK-8) est un kit de détection rapide et très sensible basé sur le réactif WST-8 (2-(2-méthoxy-4-nitrophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfophényl)-2H-tétrazolium sel monosodique). Le WST-8 est un réactif amélioré du MTT et peut être réduit en formazan orange-jaune hautement soluble dans l'eau par les déshydrogénases dans les mitochondries. La quantité de formazan générée est proportionnel au nombre de cellules vivantes. La valeur OD du formazan à 450 nm détectée par un lecteur de microplaques peut indiquer indirectement le nombre de cellules viables. Ce kit est largement utilisé pour le criblage de médicaments, les tests de prolifération cellulaire et de cytotoxicité, les tests de sensibilité aux médicaments contre les tumeurs et la détection d'activité de facteurs biologiques.
Avantages de la méthode CCK-8
1. Comparaison de la méthode CCK-8 avec d’autres méthodes de détection de prolifération/toxicité cellulaire.
| Méthode de détection | Méthode MTT | Méthode XTT | Méthode WST - 1 | Méthode CCK 8 |
|---|---|---|---|---|
| Solubilité dans l'eau du produit formazan | Faible (il faut ajouter un solvant organique pour dissoudre puis tester) | Haut | Haut | Haut |
| Caractéristiques du produit | Poudre | 2 bouteilles de solution | Solution | 1 bouteille de solution |
| Mode d'emploi | Mélanger dans la solution et utiliser | La solution a été préparée juste avant utilisation. | Prêt à l'emploi | Prêt à l'emploi |
| Sensibilité de détection | Haut | Très haut | Très haut | Haut |
| Détection temps | Long | Court | Court | Le plus court |
| Longueur d'onde de détection | 560-600 nm | 420-480 nm | 420-480 nm | 430-490 nm |
| cytotoxicité | Forte toxicité, disparition complète de la morphologie cellulaire | Faible toxicité, morphologie cellulaire inchangée | Faible toxicité, morphologie cellulaire inchangée | Faible toxicité, morphologie cellulaire inchangée |
| Stabilité des réactifs | Général | Faible | Général | Haut |
| Test d'échantillons en vrac | Possible | Approprié | Approprié | Approprié |
2. Le rouge de phénol et le sérum n’interfèrent pas avec la détection de CCK-8.
3. Comme la cytotoxicité du réactif CCK-8 est très faible, le temps de mesure optimal peut être déterminé en effectuant des lectures répétées avec un lecteur de microplaques à différents moments après l'ajout du réactif CCK-8.
Expédition et stockage
Le produit peut être conservé à -25~-15ºC dans un endroit sec et sombre pendant deux ans.
Précautions
1. Dans la première expérience, il est recommandé de déterminer le nombre optimal de cellules plaquées et le temps d'incubation optimal du réactif CCK-8.
2. Si possible, utilisez une pipette multicanaux pour réduire les variations entre les puits répliqués. Évitez les bulles dans l'expérience car elles interfèrent avec la lecture de la densité optique. Lors de l'ajout du réactif CCK-8, il est recommandé de l'ajouter près de la paroi de la plaque de culture plutôt que de l'insérer dans le milieu de culture.
3. Les globules blancs peuvent nécessiter un temps d’incubation plus long.
4. Lors de l'utilisation d'une plaque standard à 96 puits, le nombre de cellules déposées est d'au moins 1 000 cellules/puits (100 μL). La sensibilité de détection des globules blancs est relativement faible, il est donc recommandé de déposer au moins 2 500 cellules/puits (100 μL). Si vous utilisez une plaque à 24 ou 6 puits, calculez le nombre de cellules correspondant pour chaque puits et ajoutez le volume approprié de réactif CCK-8 (le volume de réactif CCK-8 ajouté est de 10 % du volume du milieu de culture dans chaque puits de la plaque).
5.Si le filtre 450 nm n'est pas disponible, un filtre avec une absorbance comprise entre 430 et 490 nm peut être utilisé, mais le filtre 450 nm peut atteindre la sensibilité de détection la plus élevée.
6. Le rouge de phénol n’affecte pas la mesure car l’absorbance du rouge de phénol dans le milieu peut être éliminée en soustrayant l’absorbance du groupe vierge.
7. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables lors de l'expérience.
Instructions
I. Réaliser une courbe standard
1. Préparez la suspension cellulaire, déterminez la densité cellulaire, puis plaquez les cellules.
2. Diluer séquentiellement les cellules avec le milieu de culture selon un certain rapport (tel qu'un rapport 1:2) pour former un gradient de concentration cellulaire, généralement 3 à 5 gradients de concentration cellulaire, 3 à 6 puits répliqués pour chaque concentration.
3. Après le placage, cultiver les cellules pendant 2 à 4 heures pour les faire adhérer. Ajouter ensuite le réactif CCK-8, incuber pendant un certain temps et mesurer la valeur de l'OD. Tracer une courbe standard avec le nombre de cellules comme axe X et la valeur de l'OD comme axe Y. Selon cette courbe standard, le nombre de cellules dans un échantillon inconnu peut être déterminé (le principe de l'utilisation de cette courbe standard est que les conditions expérimentales doivent être cohérentes).
II. Essai de viabilité cellulaire
1. Plaquer les cellules (100 μL/puits) dans une plaque à 96 puits. Placer la plaque dans un incubateur (37°C, 5% CO2) pendant une période de temps de pré-incubation.
2. Ajoutez 10 μL de réactif CCK-8 dans chaque puits (veillez à ne pas introduire de bulles dans les puits, car elles interfèrent avec la lecture de la DO) et mélangez doucement.
3. Placer la plaque dans l’incubateur et incuber pendant 1 à 4 heures.
4. Mesurer l'absorbance à 450 nm avec un lecteur de microplaques.
5. Si la valeur de la DO n'est pas mesurée immédiatement, ajoutez 10 μl de solution HCl 0,1 M ou de solution SDS 1 % p/v dans chaque puits, couvrez la plaque et conservez-la à l'abri de la lumière à température ambiante. La valeur d'absorption ne changera pas dans les 24 heures.
III. Essai de prolifération cellulaire et de cytotoxicité
1. Plaquer les cellules (100 μL/puits) dans une plaque à 96 puits. Placer la plaque dans un incubateur (37°C, 5% CO2) pendant 24 heures pour la pré-incubation.
2. Ajouter 10 μL de différentes concentrations de la substance à tester sur la plaque.
3. Placez la plaque dans l'incubateur et laissez incuber pendant une certaine période (par exemple 6, 12, 24 ou 48 heures).
4. Ajoutez 10 μL de réactif CCK-8 dans chaque puits (veillez à ne pas introduire de bulles dans les puits, car elles interfèrent avec la lecture de la DO) et mélangez doucement.
5. Placer la plaque dans l’incubateur et incuber pendant 1 à 4 heures.
6. Mesurer l'absorbance à 450 nm avec un lecteur de microplaques.
7. Si la valeur de la DO n'est pas mesurée immédiatement, ajoutez 10 μl de solution HCl 0,1 M ou de solution SDS 1 % p/v dans chaque puits, couvrez la plaque et conservez-la à l'abri de la lumière à température ambiante. La valeur d'absorption ne changera pas dans les 24 heures.
Note: Si la substance est oxydante ou réductrice, remplacez l'ancien milieu de culture par un milieu frais (retirez l'ancien milieu, lavez les cellules deux fois avec du milieu frais, puis ajoutez du milieu frais) avant d'ajouter le réactif CCK-8 pour éliminer l'effet de la substance.Si la substance elle-même n'a que un léger effet sur la valeur d'absorption, il n'est pas nécessaire de remplacer le milieu de culture et l'effet de la substance peut être éliminé en soustrayant la valeur d'absorption d'un groupe vierge avec la substance.
Formule de calcul
Taux de survie cellulaire = [(AC) /(BC)] x100%
Taux d'inhibition = [(BA) /(BC)] x100%
A : L'absorbance du groupe expérimental (l'absorbance du milieu de culture contenant les cellules, le réactif CCK-8 et la substance à tester)
B : L'absorbance du groupe témoin (l'absorbance du milieu de culture contenant les cellules, le réactif CCK-8)
C : L'absorbance du groupe vierge (l'absorbance du milieu de culture contenant le réactif CCK-8)
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