Description
Le kit de détection MycAway™ Mycoplasma qPCR est un produit conçu pour la détection qualitative de la contamination par les mycoplasmes dans diverses sources, notamment les matières premières, les banques de cellules, les semences virales, les solutions de récolte virale ou cellulaire et les cellules utilisées dans les traitements cliniques, entre autres. Ce kit utilise des sondes fluorescentes Taqman (FAM et VIC) et des techniques de réaction en chaîne par polymérase multiple (PCR) pour détecter séparément la cible et le contrôle interne. Il a été validé pour la spécificité, la limite de détection et la robustesse selon les normes EP <2.6.7>, démontrant une sensibilité, une spécificité, une efficacité et une sécurité élevées. La limite de détection est égale ou inférieure à 10 UFC/mL.
Pour l'extraction d'acide nucléique, ce produit peut être utilisé en conjonction avec le kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel magnétique MolPure® (réf. 18461), qui utilise des méthodes d'extraction manuelles. Alternativement, les acides nucléiques des échantillons peuvent être extraits automatiquement à l'aide de l'extracteur automatique d'acide nucléique AutoPure 32A (réf. 80501) et du kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel MolPure® Mag32 FA (réf. 18462). Il est important de noter que les kits contenant les références 18461 et 40619 ont subi une validation complète ; pour des informations de validation détaillées, veuillez contacter notre support technique. Après avoir prétraité les échantillons pour éliminer les impuretés interférentes et obtenu des acides nucléiques purifiés, une réaction qPCR est réalisée à l'aide d'un amplificateur PCR en temps réel, et le signal de fluorescence de la sonde est collecté et analysé.
| N° de cat. | 40619ES25 / 40619ES60 |
| Taille | 25 T / 100 T |
| Détection Limite | 10 UFC/ml |
| Détecter méthode | PCR quantitative méthode (Taqman fluorescent) |
| Durée | 4 heures |
| Fluorescent sonde | Famille (Cible canal) ; VIC (Interne canal) |
| Couvert mycoplasme | ≥ 100 |
| Validation | Validé selon à PE <2.6.7> |
Composants
| Composants N° | Nom | 40619ES25 | 40619ES60 |
| 40619-A | Tampon de réaction MyqPCR 4× | 250 μL | 1 mL |
| 40619-B | MonPrimer & Sonde MÉLANGER | 25 μL | 100 μL |
| 40619-C* | Contrôle interne (CI) | 25 μL | 100 μL |
| 40619-D** | Contrôle positif (PC) | 500 μL | 2 mL |
| 40619-F*** | Dilution de l'ADN tampon | 1 mL | 4×1 mL |
| 40619-F**** | Eau ultra pure | 500 μL | 2×1 mL |
*IC : Interne contrôle;
**PCS : Positif contrôle solution ,le concentration est 1 000 copies/µL.
***ADN Dilution tampon : utilisé pour CI dilution et le modèle de CNT et NCS.
****Ultrapur eau : utilisée pour le préparation de PCR quantitative Mélanger.
Stockage
Ce produit doit être conservé entre -25 et -15 ℃ pendant 2 ans.
*Dès réception du kit, veuillez vérifier si tous les composants sont complets et les stocker immédiatement à -25~-15℃ condition si le test n'est pas effectué immédiatement. Veuillez noter que le 40619-B doit être conservé à l'abri de la lumière.
Instructions
- Préparations avant l'expérience
1) Préparez les réactifs et le matériel nécessaires qui seront utilisés dans l’expérience.
2) Confirmer l'adéquation de l'instrument qPCR
Ce kit peut être utilisé sur les types d'instruments qPCR ci-dessous :
- Bio-Rad : CFX96
- Thermo Scientific : Système PCR en temps réel 7500 ; QuantStudio™5 ;
- Méthode expérimentale
1) Extraction d'ADN
Nous vous recommandons d'utiliser ' Kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel magnétique (Cat#18461ES pour extraction manuelle et Cat#18462ES pour extraction automatique) pour le Extraction d'ADN, toi peut visite ' http:/www.yeasenbiotech.com ' pour le
informations détaillées et l'achat.
Le kit (Cat#40619ES) contient un contrôle interne (CI). Si vous ajoutez le CI aux échantillons avant l'extraction de l'ADN, il peut vérifier le processus complet (extraction de l'ADN et réaction qPCR incluses). Si vous ajoutez le CI au mélange maître qPCR
directement, le CI agira uniquement comme un contrôle qPCR.
2) Préparation du mélange qPCR
- Selon la quantité d'échantillon qui comprenait le contrôle positif (PCS), le contrôle sans modèle (NTC) et le contrôle négatif solution de contrôle (NCS) et échantillon test (TS) pour calculer le nombre de réactions. Préparez 2 réactions en parallèle pour
chaque échantillon en général.
* PCS : positif contrôle solution ; NTC : Non modèle contrôle ; NCS : négatif contrôle solution ; TS : Test échantillon. Il y a est Non besoin à effectuer
le échantillon extraction pour PC et CNT, mais NCS et TS sont nécessaire.
Puits de réaction (M1) = (1 × NCS + N×TS） ×2
Puits de réaction (M2) = (1 × PCS + 1 × NTC) ×2
Puits de réaction (M3) = (1 × PCS + 1 × NTC + N × TS) ×2
- Pré-décongeler la quantité requise de réactifs sur de la glace conformément au plan d’expérience et aux tableaux ci-dessous.
- Calculez la quantité de mélange qPCR en fonction du nombre de réactions. Veuillez noter que si le kit doit être utilisé pour des activités GMP telles que la libération de produits, nous recommandons d'utiliser les tableaux 1 et 2 pour la préparation. le kit va juste utilisé pour la recherche et il n'est pas nécessaire d'ajouter du CI avant l'extraction après l'évaluation, puis suivez le tableau 3 pour
la préparation. Veuillez noter que tous les M1, M2 et M3 ne sont nécessaire pour être préparer.
| Composant | Volume (1 × 40 μL de réactions) | Volume (M1 × 40 μL) |
| 4× Tampon de réaction MyqPCR | 10 μL | (M1+2) ×10 μL |
| MonPrimer & Sonde MÉLANGER | 1 μL | (M1+2) ×1 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M1+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Eau purifiée | Jusqu'à 20 μL | Jusqu'à (M1+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M1+2) ×20 μL |
Tableau 1 Système de mélange qPCR pour M1
*Le configuration système dans Tableau 1 est basé sur le prémisse que CI est ajouté avant extraction pour les deux NCS et TS, donc il est pas nécessaire
à ajouter CI quand PCR quantitative Mélanger préparation. IC ajout méthode avant extraction: Tout d'abord, diluez CI par 20 fois avec ADN diluant, et ajouter 1 μL
dilué CI dans chaque 100 μL test échantillon pour le plus loin extraction.
**Ce trousse fait pas contenir ROX Référence Colorant. Si ROX référence colorant est nécessaire pour le Réel Temps PCR amplificateurs que toi sont actuellement en utilisant, 50×ROX Référence Colorant (Cat#10200ES) est recommandé pour utiliser. Dans ce cas, le ajouté volume est 0,8 μL, comme montré dans Tableau 1. Si en utilisant autre
marques de ROX produits, s'il vous plaît référer à leur instructions pour ROX ajout.Si Non ROX référence colorant est requis, le ajouté volume est 0 μL.
| Composant | Volume (1 × 40 μL de réactions) | Volume (M2 × 40 μL) |
| 4× Tampon de réaction MyqPCR | 10 μL | (M2+2) ×10 μL |
| MonPrimer & Sonde MÉLANGER | 1 μL | (M2+2) ×1 μL |
| Contrôle interne (CI) | 1 μL* | (M2+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M2+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Purifié eau | Jusqu'à 20 μL | Jusqu'à (M2+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M2+2) ×20 μL |
Tableau 2 Système de mélange qPCR pour M2
*Le configuration système dans Tableau 2 est basé sur le prémisse que CI est pas ajouté dans PC et CNT avant extraction, donc CI besoins à être ajouté pendant PCR quantitative Mélanger préparation. IC ajout méthode après extraction: Diluer CI par 100 fois avec ADN diluant et ajouter 1 μL dilué CI dans
chaque PCR quantitative Mélanger système.
**Ce trousse fait pas contenir ROX Référence Colorant. Si ROX référence colorant est nécessaire pour le Réel Temps PCR amplificateurs que toi sont actuellement en utilisant, 50×ROX Référence Colorant (Cat#10200ES) est recommandé pour utiliser. Dans ce cas, le ajouté volume est 0,8 μL, comme montré dans Tableau 1. Si en utilisant autre
marques de ROX produits, s'il vous plaît référer à leur instructions pour ROX ajout. Si Non ROX référence colorant est requis, le ajouté volume est 0 μL.
| Composant | Volume (1 × 40 μL de réactions) | Volume (M3 × 40 μL) |
| 4× Tampon de réaction MyqPCR | 10 μL | (M3+2) ×10 μL |
| MonPrimer & Sonde MÉLANGER | 1 μL | (M3+2) ×1 μL |
| Contrôle interne (CI) | 1 μL* | (M3+2) ×1 μL /0 μL |
| ROX | 0,8 μL /0 μL** | (M3+2) ×0,8 μL /0 μL |
| Purifié eau | Jusqu'à 20 μL | Jusqu'à (M3+2) ×20 μL |
| Total | 20 μL | (M3+2) ×20 μL |
Tableau 3 Système de mélange qPCR pour M3
*Le configuration système dans Tableau 3 est basé sur le prémisse que CI est pas ajouté à échantillons avant extraction, donc CI besoins à être ajouté pendant PCR quantitative Mélanger préparation. IC ajout méthode après extraction: Diluer CI par 100 fois avec ADN diluant et ajouter 1 μL dans chaque PCR quantitative Mélanger
système.
**Ce trousse fait pas contenir ROX Référence Colorant. Si ROX référence colorant est nécessaire pour le Réel Temps PCR amplificateurs que toi sont actuellement en utilisant, 50×ROX Référence Colorant (Cat#10200ES) est recommandé pour utiliser. Dans ce cas, le ajouté volume est 0,8 μL, comme montré dans Tableau 1. Si en utilisant autre
marques de ROX produits, s'il vous plaît référer à leur instructions pour ROX ajout. Si Non ROX référence colorant est requis, le ajouté volume est 0 μL.
3) Ajout de modèles
- Mélanger le mélange qPCR en agitant suffisamment, centrifuger à basse vitesse et recueillir le liquide résiduel du bouchon.
jusqu'au fond de le tube.
- Ajouter 20 µL de mélange qPCR dans chaque tube/puits de réaction. Veuillez noter l'ajout du mélange qPCR correspondant dans chaque
tubes d'échantillons et éviter d'ajouter des erreurs.
- Ajoutez des modèles au tube/puits contenant le mélange qPCR. Voir le tableau 4 pour l'ajout de modèles.
| Échantillons de test | Dans chaque tube ou Bien … |
| TS | 20 μL qPCR Mix+20 Échantillons μL après extraction |
| CNT | 20 μL qPCR Mix+20 μL ADN Dilution tampon |
| NCS* | 20 μL qPCR Mix+20 μL Échantillon négatif après extraction* |
| PC | 20 μL qPCR Mix +20 μL positif contrôle |
Tableau 4 modèles ajout
*Nous recommandons d'utiliser le tampon de dilution d'ADN (40619-E) comme modèle de NCS pour l'extraction d'ADN.
**Le total réaction volume dans chaque tube/puits est 40 μL.
***Couverture le tube couvercle ou le plaque film. À éviter affectant le fluorescence signal en train de lire, s'il vous plaît prendre soins pas à marque le tube couvercle ou film
ou même frotter le film à plusieurs reprises avec un grattoir.
****Centrifuger le réaction tube ou plaque brièvement à faible vitesse après modèles ajout. Après suffisant tremblement et mélanger, répéter centrifuger
à faible vitesse à collecter le liquide depuis le couvercle ou mur à le bas. Éviter bulles quand opération. Le ligne de base volonté être impacté si le mélanger
est pas mixte Eh bien, alors ce étape est très important à un bien expérience résultat.
4) Configuration des programmes qPCR
- Paramètres du fichier programme
Exemple (instrument système PCR en temps réel 7500 et logiciel PCR en temps réel v2.4) :
Type d'instrument : 7500 (96 puits)
Type d'expérience : Quantification - Courbe standard ;
Chimie : Réactifs Taqman®
Vitesse de rampe : Standard (environ 2 heures pour terminer une course)
- Paramètres du canal cible
Dans "Définir Objectifs et "Échantillons" de "Plaque Installation", créer un Cible 1 canal (FAM), sélectionner Famille comme le rapport groupe de fluorescence et MGB ou aucun comme la trempe fluorescence groupe. Créer un Cible 2 canal (VIC), sélectionner le rapport fluorescence groupe comme VIC et le trempe fluorescence groupe comme aucun. Dans "Attribuer Objectifs et "Échantillons" de "Plaque Installation", si Non supplémentaire ROX colorant est ajouté, sélectionnez "aucun"; Si un supplémentaire ROX est ajouté, sélectionnez
ROX.
- Paramètres du programme d'amplification standard
| Numéro de série | Étape de réaction | Température | Temps | Cycle(s) |
| 1 | Dénaturation initiale | 95℃ | 5 min | 1 |
| 2 | Dénaturation | 95℃ | 15 seconde |
45 |
| 3 | Recuit/Extension (collecte de signaux de fluorescence) |
62℃ |
30 secondes |
Tableau 5 Paramètres du programme d'amplification standard
- Définition de la ligne de base et du seuil :
Principe de ligne de base ajustement: utiliser le automatique ligne de base en général. Si besoin à ajuster dans manuel, choisir le faire du vélo avant la croissance exponentielle période comme cycle de démarrage et éviter la zone de fluctuation de initial fluorescence collection. Choisissez le cycle qui est 1 à 2 cycles avant le Ct de l'échantillon d'amplification exponentielle le plus ancien comme
point final.
Principe de seuil réglage : utilisez généralement le seuil automatique. Si vous devez régler manuellement, le seuil devrait être ensemble plus haut que le Négatif échantillon ou le ligne de base bruit, c'est en général ensemble le seuil dans le en retard
étape de l'amplification exponentielle, relative indépendante et un seuil adapté sont nécessaires pour chaque tunnel.
5) Résultat Analyse
- Jugement des résultats pour PCS, NTC et NCS :
Si IC ajouté : la spécification de chaque échantillon de contrôle doit être satisfait dans le tableau 6 :
| Échantillon de contrôle | Famille Signal | Signalisation VIC |
| PC | Ct < 40, et présente une courbe d'amplification évidente | Ct < 40 et présente une courbe d'amplification évidente |
| CNT | Ct ≥ 40 ou aucune courbe d'amplification évidente | Ct < 40 et présente une courbe d'amplification évidente |
| NCS | Ct ≥ 40 ou aucune courbe d'amplification évidente | Ct < 40 et présente une courbe d'amplification évidente |
Tableau 6 Résultat jugement de PC, NTC et NCS
Si IC n'est pas ajouté : chaque échantillon de contrôle qualité doit répondre à la spécification de la colonne de signal FAM du tableau 6, et aucun
besoin d'analyser Chaîne VIC.
- Jugement des résultats pour TS
Condition préalable: Il est nécessaire de déterminer si PC, CNT et NCS passé la spécification dans le tableau 6 avant TS analyse des résultats. Si c'est adopté, alors peut-on procéder à la prochaine étape. Sinon passé, le TS résultats peut pas être fiable, et
la raison doit être étudiée.
Si IC ajouté : trouver les résultats correspondants jugement selon les informations de résultat de FAM et VIC dans le tableau 7 :
| Famille Signal | Signalisation VIC | Résultat jugement |
| Ct<40 et a des signes évidents courbe d'amplification | Ct<40 et présente une courbe d'amplification évidente | Positif |
| Ct≥40 ou aucune courbe d'amplification évidente | Une inhibition existe, la l'expérience doit être répétée | |
| Ct≥40 ou pas évident courbe d'amplification | Ct<40 et présente une courbe d'amplification évidente | Négatif |
| Ct≥40 ou aucune courbe d'amplification évidente | Une inhibition existe, la l'expérience doit être répétée |
Tableau 7 : Résultat jugement de TS (CI (ajouté)
*Si là est inhibition pour VIC signal, traitement est nécessaire à éliminer le inhibiteurs ou répéter le test.
Si IC non ajouté : trouver les résultats correspondants jugement selon les informations sur les résultats de FAM dans le tableau 8 , et il n’est pas nécessaire d’analyser le Signal VIC.
| Signal FAM | Résultat jugement |
| Ct<40 et présente une courbe d'amplification évidente | Positif |
| Ct≥40 ou aucune courbe d'amplification évidente | Négatif |
Tableau 8 : Résultat jugement de TS (CI pas (ajouté)
Remarques
- Veuillez lire attentivement ce manuel avant d'utiliser ce kit. L'expérience doit être menée de manière standardisée, y compris la manipulation des échantillons, la préparation du système réactionnel et l'ajout d'échantillons.
- Conservez les opérations d’ajout d’échantillons et de préparation de réactifs sur de la glace si possible.
- Vortexer et bien mélanger chaque réactif avant utilisation.
- Veuillez utiliser des blouses de laboratoire et des gants jetables, pour Votre sécurité.
- Ce produit est destiné à la recherche uniquement.
[1] Zhao F, Wang X, Li Y, Chen X, Geng Z, Zhang C.Effets de la supplémentation alimentaire en gallate d'épigallocatéchine sur la qualité de la viande et la capacité antioxydante des muscles des poulets de chair soumis à un stress thermique aigu. Animaux (Bâle). 2021 ; 11(11) : 3296. Publié le 18 novembre 2021. doi : 10.3390/ani11113296(IF : 2.752)
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