Le polybrène (bromure d'hexadiméthrine), également connu sous le nom de polybrène, est un polymère cationique couramment utilisé dans les expériences de transfection d'ADN avec des cellules de mammifères pour améliorer l'efficacité de la transfection des liposomes. Il est largement utilisé dans la transfection génique à médiation rétrovirale et la transfection génique à médiation lentivirale. Le mécanisme d'action peut impliquer la neutralisation de l'acide sialique à la surface cellulaire, facilitant l'adsorption en surmontant la répulsion électrostatique avec les particules virales. Le polybrène est également reconnu comme un anticoagulant (antagoniste de l'héparine) et est fréquemment utilisé dans la production de globules rouges agrégés de manière non spécifique. De plus, dans le séquençage des protéines, de faibles doses de polybrène se sont avérées améliorer considérablement la dégradation des peptides dans l'analyse de séquençage automatisé. L'ajout de polybrène aux membranes PVDF peut également améliorer l'affinité membranaire.

Spécification

Le produit est fourni sous forme de solution et la poudre est reconstituée dans du NaCl à 0,9 % pour obtenir une solution à 10 mg/mL, qui est ensuite stérilisée à l'aide d'un filtre de 0,22 μm. Elle est généralement diluée dans un rapport de 1:1000-1:2000 pour l'utilisation, avec des rapports de dilution spécifiques en fonction du type de cellule, comme indiqué dans la littérature pertinente.

Expédition et stockage

Le transport et le stockage sont recommandés à -20 ºC, avec une durée de conservation de 2 ans. Il est conseillé de procéder à un aliquotage et de stocker pour éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.

Précautions:

1. Portez une tenue de laboratoire et des gants jetables pour des raisons de sécurité et de santé.

2. Ce produit est destiné à des fins de recherche uniquement.

Étapes opérationnelles

(pour référence, les concentrations spécifiques peuvent varier, reportez-vous à la littérature pertinente) :

Remarque : le polybrène peut présenter une toxicité importante pour certaines cellules (telles que les neurones différenciés en phase terminale, les cellules DC), et un test de toxicité est recommandé pour une utilisation initiale.

Expérience 1 : Infection rétrovirale

1. Préparation d'un stock de rétrovirus recombinant : Culture de cellules contenant une monocouche de cellules d'emballage de rétrovirus de transfection dans une boîte de 100 mm avec 5 ml de milieu de croissance (5 % de sérum). Après 24 heures, retirer le milieu de culture et le filtrer à travers un filtre de 0,45 µm.

2. Culture de cellules pour l'infection : Dans une boîte de 100 mm, ajouter 10 ml de milieu de croissance complet avec une densité cellulaire de 5×10⁵ par plat.

3. Infection virale : après 24 heures de culture cellulaire, retirer l'intégralité du milieu de culture. Infecter les cellules avec 2 ml de surnageant viral contenant du Polybrene (concentration finale : 5-10 μg/ml) à 37 °C pendant 3 à 6 heures.

4. Recueillir les particules virales : ajouter 8 ml de milieu de culture complet. Après 2 à 3 jours de culture, recueillir le milieu de culture pour obtenir des particules virales.

Expérience 2 : Transfection

1. Cultiver les cellules dans un milieu de croissance complet avec une densité cellulaire d’environ 50 %.

2. Après 18 à 24 heures de culture cellulaire, préparer un mélange ADN-milieu de croissance-Polybrène. Ajouter le milieu de croissance complet (2 ml pour une boîte de 60 mm, 3 ml pour une boîte de 100 mm) et préchauffer à 37 °C. Mélanger délicatement 10 ng à 10 µg de plasmide. Ajoutez Polybrene jusqu'à obtenir une concentration finale de 5 à 10 μg/mL. Mélangez délicatement. Chaque composant doit être ajouté dans l'ordre indiqué.

3. Retirer le milieu de culture et ajouter la solution de milieu de croissance d'ADN-Polybrène aux cellules à 37°C pendant 6 à 20 heures. Mélanger doucement toutes les 1,5 heures au cours des 6 premières heures de culture cellulaire.

4. Retirer la solution de milieu de croissance d'ADN-Polybrène. Couvrir les cellules avec une solution choc de DMSO (15 % de DMSO dans 1 × HBSS).Agiter doucement la boîte de culture pendant 10 secondes à chaque ajout de solution pour assurer une distribution uniforme. Incuber les cellules à 37°C pendant 4 minutes.

5. Retirer immédiatement la solution choc de DMSO et laver délicatement les cellules deux fois avec du milieu de culture complet. Pour une boîte de 60 mm, laver avec 5 ml de milieu de culture à chaque fois, et pour une boîte de 100 mm, laver avec 10 ml de milieu de culture à chaque fois.

6. Ajoutez du milieu de croissance complet aux cellules.

7. Expression des protéines : après 24 à 72 heures de culture, collectez les cellules pour une analyse de l'expression des protéines si nécessaire.

Sélection cellulaire : après 24 à 72 heures de culture, en fonction de l'état des cellules, passez au milieu de sélection frais et poursuivez la sélection cellulaire.