Véro Le kit de détection des résidus d'ADN des cellules hôtes est utilisé pour l'analyse quantitative des résidus d'ADN des cellules hôtes Vero dans des échantillons intermédiaires, des produits semi-finis et finis de divers produits biologiques.

Ce kit utilise une sonde fluorescente Taqman et la méthode de réaction en chaîne par polymérase (PCR), qui a une limite de détection minimale de niveau fg et peut détecter spécifiquement et rapidement l'ADN résiduel des cellules Vero. Le kit doit être utilisé avec le kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel (réf. 18461ES).

Produit Composants

^*IC : Contrôle interne

Expédition et stockage

1. Expédié sur glace sèche et stocké à -20°C pour 2 année

2. Après avoir reçu les marchandises, veuillez les vérifier et les stocker immédiatement à la température de stockage correspondante.

Précautions

1. Veuillez lire attentivement ce manuel avant d'utiliser ce réactif. L'expérience doit être standardisée, y compris la manipulation des échantillons, la préparation du système de réaction et l'ajout d'échantillons.

2. Il est préférable d’ajouter des échantillons et de préparer des solutions sur de la glace.

3. Assurez-vous que chaque composant est entièrement vortexé et centrifugé à basse vitesse avant utilisation.

4. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter des blouses de laboratoire et des gants jetables pour l'opération.

5. Ce produit est destiné à la recherche UNIQUEMENT !

Modèles d'instruments applicables

Inclure, mais sans s'y limiter :

Bio-Rad : Module optique CFX96.

Thermo Scientifique: ABI 7500; ABI Quant Studio 5; Étape ABI OnePlus.

Utilisation des instructions

1. Véro Dilution standard d'ADN et préparation de la courbe standard

Le Véro Le contrôle de l'ADN a été dilué en gradient à l'aide du tampon de dilution de l'ADN fourni dans le kit, et la concentration de dilution est de 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL.

Voir les instructions détaillées ci-dessous :

1.1 Décongeler le Véro Contrôle de l'ADN et tampon de dilution de l'ADN sur glace. Après décongélation complète, vortexez doucement pour mélanger et centrifugez à basse vitesse pendant 10 secondes.

1.2 Retirez six tubes propres de 1,5 mL, marqués de 3 ng/μL, ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥.

1.3 Ajouter 90 μL de tampon de dilution d'ADN et 10 μL de Vero Contrôle de l'ADN au 1.Tube de microcentrifugation de 5 ml étiqueté 3 ng/μL et diluer à 3 ng/μL. Mélanger puis centrifuger pendant 10 secondes. Sous-conditionner l'ADN standard dilué et le conserver à court terme (pas plus de 3 mois) à -80°C. Éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.

1.4 Ajouter 90 μL de tampon de dilution d'ADN dans l'autre tubes, puis suivez la procédure ci-dessous pour les dilutions en série.

[Notes]:

1. Trois puits répliqués sont nécessaires pour chaque concentration. La plage de détection est de 3 fg/μL-300pg/μL et cette gamme peut être étendue si nécessaire.

2. Pour réduire le nombre de répétitions de congélation-décongélation et éviter la contamination, il est recommandé de stocker le contrôle ADN en aliquotes à -80°C pour la première fois.

3. Une fois décongelé, le tampon de dilution d'ADN pourrait être conservé à 2-8°C pendant 7 jours, si non utilisé pendant une longue période, veuillez conserver à -20°C.

4. Assurez-vous que le modèle est complètement mélangé, secouez doucement le mélange pendant 15 secondes à 1 minute pour chaque dilution de gradient.

2. Préparation du contrôle de récupération par extraction (ERC)

Régler la concentration de Véro L'ADN dans l'ERC selon les besoins (l'échantillon ERC a été préparé avec 3 pg/μL d'ADN à titre d'exemple), comme suit :

2.1 Ajoutez 100 μL d'échantillon de test dans un tube propre de 1,5 mL, puis ajoutez 10 μL de Vero 3pg/μL Étalon ADN (③) et bien mélanger, marqué ERC.

2.2 Effectuer l'extraction d'ADN de l'échantillon ERC avec les échantillons de test pour préparer l'ERC purifié échantillon.

3. Préparation de l'échantillon de contrôle positif (PCS) (facultatif)

Régler la concentration de Véro L'ADN dans le SCP selon les besoins (le PCS a été préparé avec 3 pg/μL d'ADN à titre d'exemple), comme suit :

3.1 Ajouter 100 μL de Vero 3 pg/μL Norme ADN (③) dans un tube propre de 1,5 ml, puis marqué PCS.

3.2 Effectuer l'extraction d'ADN du PCS avec les échantillons d'essai pour préparer le PCS purifié.

4. Négatif Préparation de la solution de contrôle (NCS)

Définissez le contrôle négatif dans l'expérience, les étapes de fonctionnement spécifiques sont les suivantes :

4.1 Ajouter 100 μL échantillon de matrice (ou tampon de dilution d'ADN) dans un tube propre de 1,5 ml, puis marqué comme NCS.

4.2 Effectuer l’extraction d’ADN de l’échantillon NCS avec les échantillons de test pour préparer l’échantillon NCS purifié.

5. Préparation sans contrôle de modèle (NTC)

Définir le modèle non défini contrôle dans l'expérience, les étapes de fonctionnement spécifiques sont les suivantes :

5.1 NTC ne nécessite aucun prétraitement d'échantillon et peut être configuré au stade de la détection qPCR du contenu d'ADN résiduel.

5.2 L'échantillon NTC dans chaque tube ou puits est de 20 μL Mélanger (c'est-à-dire 16 μL Mélange Vero qPCR + 4 μL Mélange d'amorces et de sondes Vero + 20 μL Tampon de dilution d'ADN. Il est recommandé de configurer trois puits répliqués.

6. Système de réaction PCR

[Notes]:

1. Calculer le volume total de la réaction PCR en fonction du nombre de réactions : qPCR Mix = (nombre de réactions + 2) × (16 + 4) μL (y compris les pertes de deux puits de réaction). Il est recommandé d'effectuer plus de trois réplicats pour chaque échantillon dans l'expérience.

2. Après avoir bouché le tube ou scellé la plaque, centrifugez le tube ou la plaque de réaction à basse vitesse pendant 10 secondes. Après avoir suffisamment secoué et mélangé pendant 5 secondes, répétez la centrifugation pour recueillir le liquide du couvercle ou de la paroi vers le fond. Évitez les bulles pendant le fonctionnement.

Voir le tableau ci-dessous pour la configuration de plaque recommandée :

La disposition des plaques comprend : 1 NTC (non modèle contrôle), 1 NCS (contrôle négatif solution), 6 STD (la courbe standard de 6 concentrations standards), 3 TS (échantillons d'essai), 3 ERC (contrôle de récupération d'extraction), 1 PCS (échantillon de contrôle positif).Trois puits répliqués pour chaque échantillon.

7. Directives de configuration pour un instrument PCR (méthode en 2 étapes)

Les instructions suivantes s'appliquent uniquement à l'instrument qPCR Thermo ABI 7500 (Version logicielle 2.0). Si vous utilisez un autre instrument, reportez-vous au guide d'instrument applicable pour obtenir des instructions de configuration.

7.1 Générez une nouvelle expérience, choisissez le modèle de quantification absolue ou défini par l'utilisateur.

7.2 Dans l'interface « Définir » et le volet « Cibles », ajoutez une cible et nommez-la FAM, choisissez le rapporteur « FAM » et le quencher « aucun ».

7.3 Dans le volet « Échantillons », ajoutez toutes les informations sur les échantillons à tour de rôle. Sélectionnez ensuite les puits, choisissez la cible et les échantillons en conséquence. Définissez la tâche de Vero Norme ADN comme norme et attribuer les valeurs 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3 (l'unité de concentration d'ADN dans chaque puits est fg/μL) dans la colonne Quantité et nommez les puits STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6, en conséquence. Définissez la tâche de NTC comme NTC. Définissez le NCS, TS, ERC et PCS comme Inconnu, et nommez-les en fonction de la disposition des plaques ci-dessus. Cliquez ensuite sur Suivant.

7.4 Définissez le programme d'amplification : définissez le volume de réaction à 40 μL.

8. Analyse des résultats de qPCR

8.1 Le système indique automatiquement le seuil dans le panneau Amplification Plot d'Analyse. Le seuil donné par le système est parfois trop proche de la ligne de base, ce qui entraîne une grande différence de Ct entre les puits répliqués. Vous pouvez ajuster manuellement le seuil à une position appropriée et cliquer sur Analyser. Vous pouvez ensuite vérifier dans un premier temps si la courbe d'amplification est normale dans le graphique multicomposant.

8.2 Dans l'onglet Analyse des résultats, examinez le tracé de la courbe standard. Vérifiez les valeurs de la pente, de l'ordonnée à l'origine et de R2 et efficacité. Pour une courbe standard normale, R²>0,99 ; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 Dans le 'Tableau des puits de vue' panneau dans Analyse, les concentrations de chaque échantillon sont affichées dans Quantité, l'unité est fg/μL, les unités peuvent être converties en pg/μL ou pg/mL dans le rapport d'analyse.

Manuels