Le kit de détection de lentivirus compétent pour la réplication (RCL) est utilisé pour détecter quantitativement les lentivirus en cours de réplication qui peut se produire dans un variété de produits cellulaires associés aux lentivirus vecteurs de risques potentiels.

Ce kit conçoit des amorces spécifiques pour le Séquence du gène VSV-G des protéines d'enveloppe lentivirales. Et il adopte le taqman  sonde fluorescente et la méthode de réaction en chaîne par polymérase (PCR), qui a une limite de détection de niveau 1 copie/μL et peut détecter spécifiquement et rapidement le risque de lentivirus capable de se répliquer. Le kit doit à utiliser avec le kit de préparation d'échantillons d'ADN résiduel (réf. 18461ES).

Composants

* CI : Interne contrôle.

Stockage

Ce produit doit être stocké entre -25 et -15 ℃ pour 2 années.

Les produits 41311-A et 41311-B doivent être conservés à l'abri de la lumière.

En vigueur instrument modèles

Inclure, mais sans s'y limiter : Bio-Rad : module optique CFX96 ; Thermo Scientific : ABI 7500; ABI Quant Studio 5; Étape ABI OnePlus.

Instructions

1. ADN RCL Standard dilution et Standard courbe préparation

Le contrôle ADN RCL a été dilué en gradient à l'aide du tampon de dilution ADN fourni dans le kit* , et la dilution la concentration est de 5×10E7 copies/μL, 5×10E6 copies/μL, 5×10E5 copies/μL, 5×10E4 copies/μL, 5×10E3 copies/μL, 5×10E2 copies/μL, 5×10E1 copies/μL.

Voir les instructions détaillées ci-dessous :

1) Décongeler le contrôle ADN RCL et le tampon de dilution ADN sur de la glace. Après avoir complètement décongelé, vortexer doucement pour mélanger, et centrifuger à basse vitesse pendant 10 secondes.

2) Retirez sept tubes propres de 1,5 ml, marqués Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6.

3) Ajouter 90 μL de tampon de dilution d'ADN et 10 µL de contrôle ADN RCL dans le tube à centrifuger de 1,5 mL étiqueté Std0, à savoir   diluer à 5×10E7 copies/μL. Mélanger et puis centrifuger pendant 10 secondes. Sous-emballer l'ADN standard dilué et il peut être stocké à court terme (pas plus de 3 mois) à -25~-15℃** Veuillez éviter les cycles de gel-dégel répétés.

4) Ajouter 90 μL de tampon de dilution d'ADN dans d'autres tubes*** , puis suivez la procédure ci-dessous pour les dilutions en série **** .

Tableau 1 Dilution du gradient standard

*Trois reproduire puits sont requis pour chaque concentration.La détection gamme est 5×10E1 copies/μL~5×10E6 copies/μL et ce gamme peut être développé si nécessaire.

** À réduire le nombre de répéter gel-dégel et éviter contamination, il est recommandé à magasin le ADN contrôle dans aliquotes à -25~-15℃ pour le d'abord temps.

*** Une fois décongelé, ADN dilution tampon pourrait être stocké à 2-8°C pour 7 jours, si pas utilisé pour un long l'heure, s'il vous plaît magasin à -25~-15℃ .

**** Faire bien sûr le modèle est complètement mélangé, doucement secouer le mélange pour 15 secondes à 1 min pour chaque pente dilution.

2. Extraction Récupération Contrôle (CER) préparation

Réglez la concentration d'ADN RCL dans l'ERC selon les besoins (l'échantillon ERC a été préparé avec 5 × 10E4 copie l'ADN du RCL comme un exemple), comme suit :

1) Ajouter 100 Échantillon de test μL dans un tube propre de 1,5 mL, puis ajoutez 10 µL 5×10E3 copies/μL RCL DNA Standard (Std4) et bien mélanger, marqué ERC.

2) Effectuer l’extraction d’ADN de l’échantillon ERC avec les échantillons de test pour préparer l’échantillon ERC purifié.

3. Contrôle négatif Solution (NCS) préparation

Définissez le contrôle négatif dans l'expérience, les étapes de fonctionnement spécifiques sont les suivantes :

1) Ajouter 100 μL de matrice d'échantillon (ou tampon de dilution d'ADN) dans un tube propre de 1,5 mL, puis marqué comme NCS.

2) Effectuer l'extraction d'ADN du NCS échantillon avec les échantillons d'essai pour préparer le NCS purifié échantillon.

4. Pas de modèle Contrôle (NTC) préparation

Définissez le contrôle sans modèle dans l'expérience, les étapes de fonctionnement spécifiques sont les suivantes :

1) Le NTC ne nécessite aucun prétraitement de l'échantillon et peut être configuré au stade de la détection qPCR de l'ADN résiduel contenu.

2) L'échantillon NTC dans chaque tube ou puits est de 20 μL Mélange (soit 15 μL RCL qPCR Mix + 4 μL RCL Amorce et sonde Mélanger + 1 μL IC) + 10 Tampon de dilution d'ADN µL. Il est recommandé de configurer trois puits répliqués.

5. PCR réaction système

Tableau 2 Système réactionnel

* Calculer le total PCR réaction volume par le nombre de réactions : qPCR Mélanger =(le nombre de réactions+2) × (15+4+1) μL (y compris le pertes de deux puits de réaction). Plus de trois répliques pour chaque échantillon sont recommandées dans l'expérience.

** Après plafonnement le tube ou scellage le plaque, centrifugeuse le réaction tube ou plaque à faible vitesse pour 10 secondes. Après suffisant tremblement et mélange pour 5 secondes, répéter centrifuger à collecter le liquide depuis le couvercle ou mur à le bas. Éviter bulles pendant opération.

Voir le tableau ci-dessous pour la configuration de plaque recommandée :

Tableau 3 Ordinateur allumé référence conseil

La disposition de la plaque comprend : 6 Std (la courbe standard de 6 concentrations standard), 1 NTC (aucun contrôle de modèle), 1 NCS (solution de contrôle négatif), 3 TS (échantillons de test), 3 ERC (témoin de récupération d'extraction).Trois puits répliqués pour chaque échantillon.

6. Consignes d'installation pour un PCR Instrument

Les instructions suivantes s'appliquent uniquement à Thermo Instrument qPCR ABI 7500 (logiciel) version 2.0). Si vous utilisez un instrument différent, reportez-vous au guide de l'instrument applicable pour les directives de configuration.

1) Générer une nouvelle expérience, choisir le modèle de quantification absolue ou défini par l'utilisateur.

2) Créez 1 sonde de détection, nommée « RCL-DNA », sélectionnez le fluorophore rapporteur comme « FAM » et éteignez le fluorophore comme « aucun » ; créez 1 sonde de détection supplémentaire, nommez-la « IC » et sélectionnez le fluorophore rapporteur « CY5 » et éteignez-la fluorophore comme « aucun ». La fluorescence de référence est ROX" (la fluorescence de référence peut être basée sur la modèle d'instrument, etc., sélectionnez si vous devez l'ajouter).

3) Dans le Dans le volet « Échantillons », ajoutez toutes les informations sur les échantillons à tour de rôle. Sélectionnez ensuite les puits, choisissez la cible et les échantillons en conséquence. Ensemble la tâche de la norme ADN RCL en tant que norme et attribuer la valeurs 5000000, 500000, 50000, 5000, 500, 50 (l'unité de concentration d'ADN dans chaque puits est les copies/μL) dans la colonne Quantité et nommez le  puits Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6, respectivement. Réglez le tâche du NTC en tant que NTC. Définissez le NCS, le TS et l'ERC comme Inconnu, et les a nommés en fonction de la disposition des plaques ci-dessus en conséquence. Cliquez ensuite sur Suivant.

4) Définissez le programme d'amplification : définissez le volume de réaction à 30 μL.

Tableau 4 Procédure d'amplification

7. Analyse de PCR quantitative résultats

1) Le système donnera automatiquement le seuil dans le Panneau de tracé d'amplification de Analyse. Le seuil donné par le système est parfois trop proche de la ligne de base, ce qui entraîne une grande différence dans Ct entre les puits répliqués. Vous pouvez régler manuellement le seuil à une position appropriée et cliquez Analysez. Ensuite, vous pouvez d'abord vérifier si la courbe d'amplification est normale dans le graphique multicomposant.

2) Dans le résultat Onglet Analyse, examinez le tracé de la courbe standard. Vérifiez le valeurs pour le R2, l'efficacité, la pente et Ordonnée à l'origine. Pour une courbe standard normale, R²>0,99, 90%≤Eff%≤110%, -3,6≤Pente≤-3,1.

3) Dans le 'Voir Eh bien, le panneau de la table Analyse, les concentrations de chaque échantillon sont indiquées en Quantité, l'unité est en copies/μL, les unités peuvent être converties dans le rapport d'analyse.

4) Les réglages des paramètres de l'analyse des résultats doit être basée sur le modèle spécifique et le logiciel version utilisé et peut généralement être interprété automatiquement par l'instrument.

5) Calculez le taux de récupération des pics en fonction des résultats des tests de l'échantillon TS à mesurer et le pic d'échantillon récupération ERC, le taux de récupération de des pointes sont nécessaires être compris entre 50 % et 150 %. Formule du compteur de taux de récupération à pointes :

Récupération (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x Volume d'élution (μL) / Théorique valeur de la quantité d'ADN ajoutée (par exemple, copies) x 100%.

6) Le CT valeur de le contrôle négatif NCS devrait être supérieur à la moyenne de la plus faible concentration Ct de le standard.

7) Modèle de contrôle NTC gratuit devrait être indéterminé ou Ct valeur ≥38.

Remarques

1. Ce produit est destiné à la recherche uniquement.
2. Veuillez travailler avec des blouses de laboratoire et des gants jetables, pour votre sécurité.

3. Veuillez lire attentivement ce manuel avant d'utiliser ce réactif, et l'expérience doit être standardisée, y compris manipulation d'échantillons, préparation du système de réaction et ajout d'échantillon.

4. Assurez-vous que chaque composant est entièrement vortexé et centrifugé à basse vitesse avant utilisation.

Manuel