Le kit d'analyse des espèces réactives de l'oxygène utilise le réactif perméable aux cellules 2',7'–dichlorofluorescine diacétate (DCFDA) pour évaluer quantitativement les espèces réactives de l'oxygène dans des échantillons de cellules vivantes. Le DCFDA lipophile non fluorescent traverse facilement la membrane cellulaire par diffusion passive suivie d'une désacétylation. Le produit désacylé est une 2',7'-dichlorofluorescéine (DCHF) sensible aux oxydants. Le DCHF est ensuite oxydé par les ROS pour former le DCF. Le DCF est hautement fluorescent et est détecté par spectroscopie de fluorescence ou cytométrie de flux avec excitation/émission à 480 nm/525 nm. Rosup, un mélange de composés, est un inducteur de ROS et peut être utilisé comme contrôle positif.

Composants du produit

Expédition et stockage

Ce kit est livré avec un sac de glace. A conserver à -20°C sans lumière pendant 1 an. Eviter les congélations et décongélations répétées.

Mode d'application

1. Préparation des réactifs
Solution DCFH-DA : centrifuger brièvement à basse vitesse avant ouverture. Préparer une solution DCFH-DA de travail en diluant 10 mM de DCFH-DA dans un milieu sans sérum pour obtenir une concentration finale de 10 μM.
[Remarque] : Le DCFH-DA peut également être dilué dans un milieu sans rouge de phénol. Utilisez une solution de DCFH-DA fraîchement préparée. Le stockage à long terme du DCFH-DA dilué n'est pas recommandé. La concentration exacte de DCFH-DA requise dépendra de la lignée cellulaire utilisée, mais une plage de départ générale serait de 10 à 50 μM. Pour certaines cellules, si la fluorescence du contrôle négatif (sans sonde DCFH-DA) est très forte, diluez le DCFH-DA à 2-5 μM et réduisez le temps d'incubation de manière appropriée.
Solution Rosup : Préparez une solution de travail Rosup de 100 µM en diluant une solution mère Rosup de 100 mM dans un milieu sans sérum. En général, l'incubation avec Rosup à 37 ℃ pendant 30 min à 4 h dans l'obscurité peut augmenter considérablement les ROS.
[Remarque] : Le temps d'incubation de Rosup dépend de la sensibilité de la lignée cellulaire. Par exemple, 30 min pour Hela et 1,5 h pour MRC5. Si l'augmentation des ROS n'est pas observée dans les 30 minutes, le temps d'induction ou la concentration peuvent être augmentés de manière appropriée. Si les ROS augmentent trop rapidement, le temps d'induction ou la concentration peuvent être réduits de manière appropriée.
Médicaments : Préparez le médicament d'intérêt dans un milieu complet avec 10 % de FBS ou une autre solution appropriée à la concentration souhaitée.
2. Protocole recommandé pour les cellules adhérentes
a) Préparation cellulaire : Cultiver les cellules adhérentes dans des milieux de culture cellulaire standard la veille de l'expérience afin que la confluence cellulaire atteigne 70 % au moment de l'expérience.
b) Induction médicamenteuse : retirer le milieu. Recouvrir chaque puits avec des médicaments dilués sans sérum préalablement préparés et incuber pendant la durée souhaitée à 37°C dans l'obscurité.
c) (Facultatif) Contrôle positif : recouvrir le puits de contrôle positif avec la solution Rosup préalablement préparée et incuber pendant le temps souhaité à 37°C dans l'obscurité.
[Remarque] : Pour les cellules avec un temps de stimulation court (généralement dans les 2 heures), la sonde peut également être chargée en premier, puis ajouter Rosup ou un médicament d'intérêt.
d) Chargement de la sonde ROS : retirez tout le milieu et lavez les cellules avec un milieu sans sérum 1 à 2 fois. Recouvrez chaque puits avec la solution DCFH-DA préalablement préparée. Incubez à 37 °C pendant 30 minutes dans l'obscurité.
e) Retirez le milieu et lavez les cellules 1 à 2 fois avec un milieu sans sérum pour éliminer le DCFH-DA libre.
3. Protocole recommandé pour les cellules en suspension
a) Préparation des cellules : Cultiver les cellules en suspension jusqu'à environ 1,5 × 105 cellules par puits le jour de l'expérience.
b) Induction médicamenteuse : Recueillir les cellules dans un tube conique par centrifugation et les remettre en suspension dans une quantité appropriée de médicaments dilués sans sérum préalablement préparés et incuber pendant le temps souhaité à 37°C dans l'obscurité.
c) (Facultatif) Contrôle positif : Remettre en suspension les cellules témoins positives avec la solution Rosup préalablement préparée et incuber pendant le temps souhaité à 37°C dans l'obscurité.
d) Chargement de la sonde ROS : Recueillir dans un nouveau tube et laver les cellules par centrifugation deux fois dans du PBS. Remettre les cellules en suspension avec une solution DCFH-DA préparée précédemment avec une densité cellulaire de 1 × 106-2 × 107/mL. Incuber ensuite à 37 ℃ pendant 30 min dans l'obscurité. Inverser le tube toutes les 3 à 5 minutes pour assurer un contact complet entre la sonde et les cellules.
[Remarque] : La densité cellulaire doit être ajustée en fonction de la méthode de détection ultérieure. Par exemple, pour la cytométrie de flux, le nombre de cellules dans un seul tube ne doit pas être inférieur à 104/mL ni supérieur à 106/mL.
e) Recueillir et laver les cellules par centrifugation deux fois avec un milieu sans sérum pour éliminer le DCFH-DA libre.
4. Détection de fluorescence et analyse des données
Microscopie à fluorescence Mesure : Effectuez une microscopie de cellules vivantes avec un ensemble de filtres adaptés à la fluorescéine (FITC) à l'aide d'un microscope à fluorescence. Notez visuellement la luminosité des cellules et comparez le témoin et les échantillons ou utilisez des méthodes d'analyse d'images pour comparer les signaux entre les photographies numériques des cellules.
Mesure par cytométrie de flux : les cellules adhérentes doivent être collectées avec de la trypsine pour préparer une suspension cellulaire unique. Pour les cellules en suspension, les cellules sont collectées directement. Idéalement, 10 000 cellules doivent être analysées par condition expérimentale. Les cellules ne doivent pas être trop denses pendant l'expérience (< 1 × 106 cellules/ml). Exclure les débris et isoler la population cellulaire d'intérêt avec un filtrage. À l'aide de l'intensité fluorescente moyenne, déterminer le changement de facteur entre les échantillons témoins et traités avec Ex/Em = 480/525 nm.
Mesure de la microplaque fluorescente : mesurez immédiatement la plaque sur un lecteur de plaque fluorescente à Ex/Em = 480/525 nm en mode point final en présence de milieu. Soustrayez les lectures à blanc de toutes les mesures et déterminez le changement de pli à partir du contrôle de dosage.

Précautions

1. Lavez les cellules après incubation avec DCFH-DA pour réduire le bruit de fond.
2. Il est recommandé de mesurer la fluorescence dès que possible après l'incubation pour éviter d'éventuelles erreurs.
3. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter des blouses de laboratoire et des gants jetables pour l'opération.
4. À des fins de recherche uniquement !