La puromycine est un antibiotique aminoglycoside produit par fermentation et métabolisme de Streptomyces alboniger, qui tue les bactéries Gram-positives, diverses cellules animales et d'insectes en inhibant la synthèse des protéines. La puromycine est efficace contre E. coli dans certains cas. Le mécanisme est le suivant : puromycine est un analogue de l'extrémité 3' des molécules d'aminoyl-TrNA, qui peut se lier au site A du ribosome et être incorporé dans la chaîne peptidique étendue. Une fois que la puromycine se lie au site A, elle ne participe plus à aucune réaction ultérieure, ce qui entraîne l'arrêt prématuré de la synthèse protéique et la libération de polypeptides immatures contenant de la puromycine à l'extrémité C.

Le gène pac présent dans la souche Streptomyces alboniger productrice de puromycine code une N-acétyltransférase de puromycine (PAC) qui confère une résistance à la puromycine. Cette propriété est désormais couramment utilisée pour cribler des lignées cellulaires de mammifères transfectées de manière stable et porteuses de plasmides du gène pac.

L'application générale de la puromycine dans la sélection de transfections cellulaires stables est liée aux caractéristiques des vecteurs lentiviraux. La plupart des vecteurs lentiviraux commerciaux portent désormais le gène pac. Dans certains cas spécifiques, la puromycine peut également être utilisée pour rechercher la transformation de souches d'E. coli portant le plasmide du gène pac.

Ce produit convient à la culture cellulaire, la concentration de travail courante est de 1 à 10 µg/mL.

De plus, la société Yeasen fournit également de la puromycine (cat# 60209ES) sous forme de solution, qui se trouve dans un état différent mais a la même fonction.

Caractéristiques

Pureté≥98%

Applications

Convient à la culture cellulaire

Ssouches cellulaires de mammifères transfectées de manière stable et spécifiques à Creen, portant des plasmides porteurs du gène pac

Écran le souches d'E. coli transformées portant le plasmide du gène pac

Caractéristiques

Composants

Expédition et stockage

Le puromycin dchlorhydrate d'i les produits doivent être stockés à -15℃ ~ -25℃ pour 2 années.

Instructions

1. Concentration de travail suggérée

Cellules de mammifères : 1-10 μg/mL, la concentration optimale doit être déterminée par la courbe de destruction.

Escherichia coli : le milieu gélosé LB a été utilisé pour cribler Escherichia coli transformé de manière stable avec le gène pac à une concentration de 125 μg/mL.

Note: Le criblage de souches stables d'E. coli à l'aide de puromycine nécessite un ajustement précis du pH.

Concentrations recommandées de puromycine chlorhydrate

2. Méthode de dissolution

Dissoudre la puromycine dans de l'eau distillée pour préparer une solution mère de 50 mg/mL. Après stérilisation par filtration à 0,22 μm membrane filtrante, aliquoter et conserver à -25 à -15°CAlternativement, il peut être dissous dans du méthanol pour préparer une solution de stockage de 10 mg/mL.

3. Détermination de puromycine courbe de destruction (en prenant comme exemple la transfection shRNA ou la transduction lentivirale)

La concentration de dépistage efficace de puromycine est liée au type de cellule, à l'état de croissance, à la densité cellulaire, au métabolisme cellulaire et à la position du cycle cellulaire. Pour rechercher des lignées cellulaires shRNA exprimant de manière stable, il est essentiel de déterminer la concentration minimale de puromycine qui tue les cellules non transfectées/transduites. Il est recommandé aux clients qui effectuent des expériences pour la première fois d'établir une courbe de destruction adaptée à leur propre système expérimental.

1) Jour 1 : La plaque à 24 puits est plaquée à une densité de 5-8×104 cellules/puits, et un nombre suffisant de puits sont plaqués pour les expériences de gradient ultérieures. Les cellules ont été incubées pendant la nuit à 37°C.

2) Jour 2 : A) Préparer le milieu de criblage : milieu frais contenant différentes concentrations de puromycine (telles que 0 à 15 μg/mL, au moins 5 gradients) ; B) Remplacer le milieu de criblage fraîchement préparé dans les cellules après une incubation nocturne ; Ensuite, les cellules sont incubées à 37°C.

3) Jour 4 : Remplacer par un milieu de sélection frais et observer la viabilité cellulaire.

4) En fonction de l'état de croissance des cellules, changer de milieu de sélection frais tous les 2-3 jours.

5) Les cellules ont été surveillées quotidiennement pour observer le taux de cellules viables afin de déterminer la concentration la plus faible de médicament efficace pour tuer les cellules non transfectées ou toutes les cellules non transduites dans les 4 à 6 jours suivant le début du dépistage des antibiotiques.

4. Criblage de lignées cellulaires de mammifères transfectées de manière stable

Après transfection du plasmide contenant le gène pac, les cellules ont été propagées dans un milieu contenant de la puromycine pour sélectionner des transfectants stables.

1) 48 h après la transfection, les cellules (originales ou diluées) sont cultivées dans un milieu frais contenant une concentration appropriée de puromycine.

Remarque : les antibiotiques sont plus efficaces lorsque les cellules se divisent activement. Si les cellules sont trop denses, l'efficacité des antibiotiques sera considérablement réduite. Il est préférable de placer les cellules en plaques à une densité ne dépassant pas 25 %.

2) Retirer et remplacer le milieu de culture contenant puromycine tous les 2-3 jours.

3) Les foyers formés par les cellules sont évalués 7 jours après le dépistage. Les lésions peuvent nécessiter une semaine supplémentaire ou plus, en fonction de la lignée cellulaire hôte et de l'efficacité du dépistage par transfection.

Remarque : Surveillez l'état de croissance cellulaire tous les jours. Le dépistage de la puromycine nécessite au moins 48 heures et la période de dépistage de la concentration efficace de puromycine est généralement de 3 à 10 jours.

4) Transférer et placer 5 à 10 clones résistants dans une boîte de Petri de 35 mm et poursuivre la culture avec le milieu de sélection pendant 7 jours. Cette culture d'enrichissement sert à préparer une future expérience de cytotoxicité.

Documents:

Fiche de données de sécurité

60210_FDS_HB220421_FR.pdf

Manuels

60210_Manuel_HB250114_FR.pdf

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