Description
Le sulfate de G418, également connu sous le nom de sulfate de généticine, est un antibiotique aminoglycoside et structurellement similaire à la gentamycine B1. Il interfère avec la synthèse des protéines en se liant au ribosome 80s et en bloquant les étapes d'élongation. Le sulfate de G418 est toxique pour les cellules procaryotes et eucaryotes, y compris les bactéries, les levures, les cellules végétales et mammifères supérieures, ainsi que les protozoaires et les vers. Le gène de résistance (principalement néo), situé dans le transposon Tn601 (903) ou Tn5, est dérivé de bactéries, mais peut être exprimé dans les cellules eucaryotes. Le gène de résistance peut être introduit dans les cellules par des techniques de recombinaison génique pour obtenir une résistance au G418, qui pourrait être utilisée pour cribler et maintenir la culture de cellules procaryotes ou eucaryotes porteuses du gène de résistance.
Dans les cellules de mammifères, le néocode l'expression de l'amino-glycoside 3'-phosphotransférase (APH (3') II) après son intégration dans le génome eucaryote. Cette enzyme inactive l'antibiotique en modifiant de manière covalente la fonction amino ou hydroxyle du G418 et en inhibant l'interaction antibiotique-ribosome, conférant à la cellule une résistance au G418. Dans les expériences de criblage de lignées cellulaires stables, les courbes de destruction (courbes dose-réponse) doivent être établies pour déterminer la concentration minimale efficace pour tuer les cellules non résistantes.
Dans les cellules végétales, la résistance peut être obtenue par transfection du plasmide résistant au gène nptII. Le gène nptII code également l'aminoglycoside phosphotransférase, une enzyme qui inactive plusieurs antibiotiques, dont le G418, la kanamycine et la palomycine.
Caractéristiques
Pureté≥98%
Production standardisée, utilisant le mode de production de masse en usine
Large gamme d'applications, pouvant être utilisées dans les domaines de la biologie moléculaire et de la recherche expérimentale biochimique de la culture tissulaire
La plateforme de coopération couvre l'ensemble
Pour assurer la stabilité de la qualité du produit, la différence entre les lots est contrôlée à 1% près
Applications
Criblage de lignées cellulaires transfectées de manière stable
Caractéristiques
| N° CAS | 108321-42-2 |
| Formule moléculaire | C20H40N4O10·2H2DONC4 |
| Poids moléculaire | 692.7 g/mol |
| Pureté | ≥98% |
| Puissance（anhydre） | > 700 U/mg |
| Apparence | Poudre blanche ou blanc clair |
| Solubilité | Soluble dans H2O |
| Structure |
|
Composants
| Composants N° | Nom | 60220ES03 | 60220ES08 |
| 60220 | Sulfate de G418 (généticine) | 1 g | 5 g |
Expédition et stockage
Le Sulfate de G418 (généticine) les produits doivent être stockés à -15℃ ~ -25℃ pour 3 années.
Instructions
1. Préparation de la solution de conservation G418 (50 mg/mL, concentration active)
1) Conversion des unités d'activité
La conversion a été effectuée selon cette formule : (1000/A0) ×A1=A2
A0 : Valeur de puissance du G418, qui varie d'un lot à l'autre. Consultez le rapport de qualité du lot ou l'étiquette sur le flacon.
A1 : La concentration de G418 actif que vous désirez.
A2 : La concentration réelle de G418.
Par exemple, si la valeur d'activité du G418 du lot est de 750 U/mg et la concentration active du G418 est de 50 mg/mL, la concentration réelle de poudre à préparer est de 1000/750×50 mg/mL=66,67 mg/mL. Si 10 mL de solution de stockage de G418 (concentration active, 50 mg/mL) sont préparés, 666,7 mg de poudre doivent être pesés.
2) Stérilisation et conservation
Pesez la poudre réelle obtenue par la conversion ci-dessus et ajoutez 10 ml d’eau déionisée stérile pour la dissoudre complètement.
Préhumidifiez le filtre à aiguille de 0,22 μm avec 5 ml d’eau déionisée stérile, puis stérilisez la solution G418 par filtration.Aliquoter la solution G418 stérilisée et conserver à -20℃.
Remarque : ① Ne filtrez pas la solution trouble, car la solution n'est pas complètement dissoute, le processus de filtration entraînera une perte de médicament et réduira l'activité de la solution finale. ② Il n'est pas recommandé d'utiliser des milieux de culture, des solutions de phosphate ou des solvants organiques pour préparer la solution de stockage.
2. Concentration de criblage couramment utilisée
En général, une concentration élevée de G418 est requise initialement pour le criblage des transformants et une faible concentration est nécessaire pour maintenir la culture. Les conditions de croissance, les types de cellules et d'autres facteurs environnementaux peuvent affecter le dosage efficace de G418. Il est donc recommandé de déterminer la concentration de criblage optimale grâce à la courbe de destruction (courbe dose-réponse).
En général, la plage de criblage des cellules de mammifères est de 200 à 2 000 μg/mL, des cellules végétales : 10 à 100 μg/mL, des cellules de levure : 500 à 1 000 μg/mL.
Données expérimentales sur les lignées cellulaires
| Type de cellule | Activer la concentration | Application | Références |
| Dictyostelium | a) 10 μg/mL b) 30 μg/mL | a) Culture en milieu b) Culture sur bactéries lyophilisées | Hirth et al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982). |
| Espèces de mammifères | a) 400 à 1 000 μg/mL b) 200 μg/mL | a) Utilisé pour le dépistage b) Utilisé pour l'entretien | Canaani et Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982). |
| Usine | a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/mL | a) Utilisé pour le dépistage b) Utilisé pour l'entretien | Ursic et al., Comm. de biochimie, de biophysique et de recherche, v. 101:3, 1031-1037 (1981). |
| Levure | a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/mL | a) Utilisé pour le dépistage b) Utilisé pour l'entretien | Jiménez et Davies, Nature, v. 287, 869-871 (1980). |
| Bactéries | 16 μg/mL | Utilisé pour le dépistage | Waitz et al., Agents antimicrobiens, chimiothérapiques, v. 6:5, 579-581 (1974). |
3. Établissement de la courbe de mortalité
Remarque : afin de rechercher des lignées cellulaires présentant une expression stable des protéines cibles, il est nécessaire de déterminer la concentration minimale d'antibiotiques pouvant tuer les cellules hôtes non transfectées. Cela peut être réalisé en établissant une courbe de destruction (courbe dose-réponse). Au moins six concentrations doivent être sélectionnées. Le G418 est le plus actif lors du traitement des cellules mitotiques, les cellules doivent donc être cultivées pendant un certain temps avant d'ajouter le G418.
1) Jour 1 : Les cellules non transformées sont placées sur une plaque de culture appropriée avec une densité cellulaire de 20 à 25 % à 37 ℃ et cultivées pendant la nuit dans du CO2;
Remarque : pour les cellules nécessitant une densité plus élevée pour détecter la viabilité, la quantité d’inoculation peut être augmentée.
2) Réglez le gradient de concentration de G418 dans la plage appropriée en fonction du type de cellule. Les cellules de mammifères peuvent être réglées à 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.
3) Jour 2 : Retirer l'ancien milieu et le remplacer par un milieu fraîchement préparé contenant la concentration correspondante de médicaments. Faire trois parallèles pour chaque concentration.
4) Remplacez ensuite par un nouveau milieu contenant du G418 tous les 3 à 4 jours.
5) Le comptage des cellules vivantes est effectué à un cycle fixe (par exemple, tous les 2 jours) pour déterminer la concentration appropriée. Choisissez la concentration minimale, qui tue la majorité des cellules dans un nombre idéal de jours (généralement 7 à 10 jours), comme concentration de travail pour le criblage de cellules de transfection stable.
4. Criblage de cellules transfectées stables
1) 48 h après la transfection, le milieu de culture G418 contenant la concentration appropriée a été utilisé pour la sous-culture (sous-culture directe ou sous-culture diluée).
Remarque : afin d’obtenir de bons résultats de criblage, il est recommandé de diluer les cellules à une abondance ne dépassant pas 25 %.
2) Changer le milieu de dépistage contenant les médicaments tous les 3 à 4 jours.
3) Mesurer la formation de colonies cellulaires après 7 jours de dépistage. La formation de colonies peut prendre une semaine ou plus, selon le type de cellule hôte, la transfection et l'efficacité du dépistage.
4) 5 à 10 clones résistants ont été sélectionnés et transférés dans des plaques de culture cellulaire de 35 mm, puis cultivés avec un milieu de criblage contenant du médicament pendant 7 jours.
5) Remplacez par un support normal.
Documents:
Fiche de données de sécurité
Manuels
Chiffres
Figure 1.Test de stabilité et validation de la concentration efficace de génomycine entre différents lots
Souche expérimentale : E. coli
G69 et G99 sont deux lots différents
La concentration d'utilisation de la génomycine a été déterminée à 8 mg/L, 12 mg/L et 16 mg/L respectivement, et la concentration minimale efficace a été déterminée à 16 mg/L, ce qui a parfaitement inhibé la croissance de diverses bactéries. Les performances des deux lots étaient cohérentes.
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