L'hygromycine B, un antibiotique aminoglycoside synthétisé par Streptomyces hygroscopicus, inhibe la synthèse des protéines en interférant avec la translocation ribosomique 70S et en induisant une mauvaise lecture du modèle d'ARNm, tuant ainsi les procaryotes (tels que les bactéries), les eucaryotes (tels que les levures, les champignons) et les eucaryotes mammifères supérieurs.

Les gènes de résistance à l'hygromycine (hyg ou hph) dérivés d'Escherichia coli codent la phosphotransférase de l'hygromycine B, qui détoxifie l'hygromycine B en un produit phosphorylé non biologiquement actif, ce qui en fait un excellent marqueur sélectif pour le criblage et la culture de cellules procaryotes ou eucaryotes transfectées avec succès avec des gènes de résistance à l'hygromycine. De plus, en raison de différents modes d'action, l'hygromycine B est souvent utilisée en combinaison avec G418 ou Blasticidin S pour la sélection de lignées cellulaires à double résistance. L'hygromycine B peut également être utilisée comme agent antiviral car elle pénètre sélectivement dans les cellules dont la perméabilité membranaire est accrue en raison d'une infection virale et inhibe la traduction. Elle peut également agir comme insectifuge en étant mélangée à l'alimentation animale.

De plus, la société Yeasen propose également de l'hygromycine B (cat# 60224ES) sous forme de solution, qui se trouve dans un état différent mais qui a la même fonction.

Caractéristiques

Production standardisée, utilisant le mode de production de masse en usine

Applications

Criblage de lignées cellulaires transfectées de manière stable

Caractéristiques

Composants

Expédition et stockage

Le Hygromycine B les produits doivent être stockés à -15°C ~ -25°C pour 2 années.

Instructions

1. Préparation de la solution mère (50 mg/mL)

Pesez 0,5 g d'hygromycine B et ajoutez-la à 10 ml de 1×PBS, pH 7,4. Après dissolution complète, filtrer à travers un tamis à 0,22 μm filtre pour stériliser. Aliquoter en petits volumes à usage unique (par exemple, 1 ml) et conserver à -25 à -15°Cou 2 à 8°C.

2. Concentration de criblage couramment utilisée

La concentration de travail d'hygromycine B utilisée pour sélectionner les souches de transfert stables doit varier en fonction du type de cellule, du milieu, des conditions de croissance et du taux métabolique cellulaire, avec des concentrations recommandées de 50 à 1 000 μg/mL. Pour le premier système expérimental, une courbe de destruction (courbe de destruction), la courbe dose-réactivité, est recommandée pour déterminer la concentration de dépistage optimale.

En général, cellules de mammifères : 50-500 μg/mL; Cellules bactériennes/végétales : 20-200 μg/mL; Champignons : 300-1000 μg/mL.

3. Établissement de la courbe de mortalité

Remarque : Afin de sélectionner des lignées cellulaires stables, il est nécessaire de déterminer la concentration minimale d'antibiotiques capable de tuer les cellules hôtes non transfectées. Cela peut être réalisé en établissant une courbe de destruction (courbe dose-réponse). Au moins cinq concentrations doivent être prévues.

1) Jour 1 : Les cellules non transformées sont placées dans une plaque de culture appropriée à une densité cellulaire de 20 à 25 % et cultivées pendant la nuit.

Remarque : la quantité de cellules d’inoculation peut être augmentée pour les cellules nécessitant une densité plus élevée pour détecter la vitalité.

2) Réglez le gradient de concentration dans la plage appropriée en fonction du type de cellule.Les cellules de mammifères peuvent contenir 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Diluer la solution d'hygromycine B au 1:10 avec de l'eau déionisée ou un tampon PBS jusqu'à 5 mg/mL. Puis diluer la solution à la concentration de travail correspondante selon le tableau suivant.

3) Jour 2 : Remplacer par un milieu fraîchement préparé contenant la concentration correspondante du médicament. Faire trois échantillons parallèles pour chaque concentration.

4) Remplacez ensuite par un milieu frais contenant des médicaments tous les 3 à 4 jours.

5) Effectuez des comptages de cellules vivantes à intervalles réguliers (par exemple tous les 2 jours) pour déterminer la concentration appropriée qui inhibe la croissance des cellules non transfectées. Sélectionnez la concentration la plus faible capable de tuer la grande majorité des cellules dans le nombre idéal de jours (généralement 7 à 10 jours) comme concentration de travail pour la sélection de transfectants stables.

4. Criblage de lignées cellulaires de mammifères transfectées de manière stable

1) 48 h après la transfection, les cellules ont été sous-cultivées par un milieu de criblage contenant de l'hygromycine B à la concentration appropriée (directe ou diluée).

Remarque : les antibiotiques sont plus efficaces sur les cellules en division active. Si les cellules sont trop denses, l'antibiotique ne les tuera pas. Divisez les cellules de manière à ce qu'elles ne soient pas confluentes à plus de 25 %.

2) Changer le milieu de dépistage tous les 3-4 jours.

3) Mesurer la formation de colonies cellulaires après 7 jours de dépistage. La formation de colonies peut prendre une semaine ou plus, selon le type de cellule hôte, la transfection et l'efficacité du dépistage.

4) Choisissez 5 à 10 clones résistants et transférez-les dans des plaques de culture cellulaire de 35 mm, puis cultivez-les avec un milieu de criblage contenant du médicament pendant 7 jours.

5) Remplacer par du milieu frais sans médicament pour la culture.

Documents:

Fiche de données de sécurité

60225_FDS_HB220420_FR.pdf

Manuels

60225_Manuel_HB250115_FR.pdf