Description
L'auréobasidine A, également connue sous le nom d'AbA, de basifungine ou de bréomycine A, est un antibiotique peptidique ester cyclique isolé du champignon filamenteux Aureobasidium Pullulans No. R106. Il possède une forte capacité antifongique et est un inhibiteur de la céramide synthase phosphorylée inositol AUR1. Il est toxique pour les levures même à des concentrations plus faibles (0,1-0,5 μg/mL). Les espèces de champignons sensibles à l'auréobasidine A comprennent Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans et A. niger. Les espèces fongiques sensibles à l'auréobasidine A comprennent la levure dentaire (Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces millet (Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata (Candida glabrata), Aspergillus nidulans (Aspergillus nidulans) et Aspergillus niger (A. niger). Le mécanisme d'action est que l'auréobasidine A inhibe l'activité de l'inositol phosphoramidite (inositol phosphorylcéramide, IPC) synthase, dont dépend la croissance fongique, et interfère avec la synthèse des sphingolipides, tuant ainsi davantage la souche. D'autres gènes codant pour les synthases IPC ont été étudiés, comme le gène AUR 1 de Saccharomyces cerevisiae et le gène AURA d'A. sinensis, qui présente une homologie. La mutilation de ces gènes codants rend les souches résistantes à l'auréobasidine A, comme le gène AUR 1-C.
L'auréobasidine A est un marqueur de sélection de médicaments particulièrement adapté pour le dépistage de clones positifs. La résistance à l'auréobasidine A est également un indicateur idéal dans les études sur les hybrides simples et doubles de levure. Ce produit est une solution d'auréobasidine A dissoute dans du méthanol à une concentration de 1 mg/mL.
Caractéristiques
Pureté≥97%
Production standardisée, utilisant le mode de production de masse en usine
Applications
Études sur les levures à double hybride
Études sur un hybride de levure
Marqueur de sélection rigoureux de médicaments à base de levure
La résistance à l'auréobasidine A est un indicateur idéal pour les études d'hybridation de levure
Caractéristiques
| Numéro CAS | 127785-64-2 |
| Formule moléculaire | C60H92N8O11 |
| Poids moléculaire | 1101,42 g/mol |
| Apparence | solution liquide |
| Pureté | ≥97% |
| Solubilité | La poudre est soluble dans le DMSO et le méthanol (0.5-10 mg/mL); Insoluble dans l'eau |
| Structure |
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Composants
| Composants N° | Nom | 60231ES03 | 60231ES08 | 60231ES10 |
| 60231 | Auréobasidine A（AbA） | 1 mg (1 mg/mL) | 5×1 mg (1 mg/mL) | 10×1 mg (1 mg/mL) |
Expédition et stockage
Le Auréobasidine A（AbA） les produits doivent être stockés à -15°C ~ -25°C pour 2 années.
Instructions
1. Concentration au travail
Veuillez vous référer à la littérature pertinente pour la concentration spécifique, et explorer et optimiser en fonction de vos propres conditions expérimentales (telles que le but expérimental, le type de cellule, les caractéristiques de la culture, etc.)
2. Expérience sur les cellules (expérience in vitro)
L'auréobasidine A arrête la croissance des cellules de levure à la fois par intoxication aux céramides et par privation d'inositolphosphorylcéramides essentiels[1].
Des répétitions en tandem triples de chaque motif de boîte CArG ont été synthétisées. Tous les fragments d'ADN ont été clonés dans le vecteur Y1H pAbAi (Clontech, Mountain View, États-Unis) en utilisant des sites de restriction appropriés. Ensuite, chaque construction pAbAi assemblée a été linéarisée avec BstbI et transformée dans la souche Saccharomyces cerevisiae Y1HGold selon le manuel Yeast Transformation System 2 (Clontech, Mountain View, États-Unis). Les clones portant le fragment d'ADN souhaité ont été criblés pour l'auto-activation sur un milieu synthétique de suppression d'uracile supplémenté avec de l'auréobasidine A à une concentration de 100–900 ng/mL, comme indiqué (Clontech, Mountain View, USA)[2].
Les cadres de lecture ouverts (ORF) des gènes SlBES1 ont été amplifiés et ligaturés dans le plasmide pGBKT7-GAL4BD. Les constructions de fusion GAL4BD-SlBES1 ont été transformées dans des cellules de levure Y2H Gold.−Des plaques de milieu Trp ont été utilisées pour cultiver les transformants de levure.Le αL'activité -galactosidase des transformants a été identifiée par X-α-gal et l'expression de AUR1-C ont été examinées par l'auréobasidine A[3].
3. Concentrations minimales inhibitrices d'auréobasidine pour diverses levures
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| Souche | CMI (µg/mL) |
| S.cerevisiae | ATCC9763 (diploïde) | 0,2-0,4 |
| SH3328 (haploïde) | 0,1 | |
| Levure de saké (diploïde) | 0,1-0,2 | |
| Levure de shochu (diploïde) | 0,1 | |
| Levure de bière (triploïde ou tétraploïde) | 0,1 | |
| Boulanger's levure (diploïde) | 0,2-0,4 | |
| Schizo.pombe | JY-745 (monoploïde) | 0,1 |
| C. albicans | TIMM-0136（diploïde） | 0,04 |
| C.tropicalest | TIMM-0324（diploïde） | 0,08 |
4. Procédures opérationnelles (pour le système de transformation de levure résistante à AbA)
1) Ajouter 0,5 mL de culture de levure de nuit à 50 mL de milieu YPD (composition : 1 L de milieu liquide contient 10 g d'extrait de levure, 20 g de polypeptone, 20 g de D-glucose ; pour le milieu solide, ajouter 2 % d'agar supplémentaire).
2) Incuber à 30°C pendant environ 6 heures, jusqu'à ce que l'OD660 soit de 1 à 2. Lorsque vous utilisez des diploïdes, mesurez l'OD660 à 2-4.
3) Centrifugeuse à 1 000×g pendant 5 minutes.
4) Remettre le culot en suspension dans 10 mL de solution A (composition : 100 mM d'acétate de lithium, 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM d'EDTA), puis centrifuger à 1 000×g pendant 5 minutes.
5) Esuspendre le culot dans la solution A jusqu'à ce que la DO660 soit de 150.
6) Aliquoter 100 µL de la suspension cellulaire dans un tube et incuber à 30°C pendant 1 heure.
7) Ajoutez 5 µg du vecteur (ADN circulaire ou linéaire) et 150 µg d'ADN porteur (qui a été chauffé à 100°C pendant 10 minutes puis refroidi rapidement).
Remarque : pAUR101 nécessite un ADN linéaire pour la transformation. L'utilisation d'ADN circulaire réduira l'efficacité de la transformation ou pourrait même échouer. pAUR112 et pAUR123 nécessitent un ADN plasmidique complet pour la transformation.
8) Ajouter 850 µL de Solution B (composition : dissoudre 40 g de Polyéthylène Glycol 4000 dans 100 mL de Solution A et bien mélanger, préparer fraîche avant utilisation), et mélanger doucement.
9) Incuber à 30°C pendant 30 minutes, puis à 42°C pendant 15 minutes.
10) Placer à température ambiante pendant 10 minutes.
11) Centrifuger à 5 000 tr/min pendant 1 minute et remettre le culot en suspension dans 5 ml de milieu YPD.
12) Incuber à 30°C pendant 6 heures ou toute la nuit.
13) Centrifuger à 5 000-10 000 tr/min et remettre le culot en suspension dans 1 à 10 ml de NaCl à 0,9 %.
14) Déposer 100 µL de la suspension cellulaire sur des plaques de milieu sélectif YPD (contenant une certaine concentration d'AbA, selon le type de souche).Incuber à 30°C pendant 3 à 4 jours jusqu'à ce que la transformation soit complète.
15) Choisissez des transformants positifs et/ou déterminez l’efficacité de la transformation (exprimée en nombre de colonies transformées par microgramme d’ADN plasmidique).
Documents:
Fiche de données de sécurité
Manuels
Chiffres
Figure 1. Tableau de croissance des plaques de levure
Souche expérimentale:GS115
Quantité d'utilisation : 0,05 μg/mL、0,1 μg/mL、0,5 μg/mL、1 μg/mL
Traitement: 3-5 Jours à 30°C
La rangée supérieure est le produit Yeasen et la rangée inférieure est la marque T*.
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Enquête
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