क्या आप नग्न चूहों में ट्यूमर के विकास को वास्तविक समय में नियंत्रित करना चाहते हैं? क्या आप चूहों में कोशिका उपनिवेशण का स्थान जानना चाहते हैं? ट्यूमर पर दवा उपचार के प्रभाव को जानना चाहते हैं जीवित अवस्था मेंयह सब सेल पर ट्रैकर लगाकर किया जा सकता है, जिससे आप किसी भी समय सेल के स्थान और संख्या को नियंत्रित कर सकते हैं। यह तकनीक इन विवो इमेजिंग "डिटेक्शन" तकनीक है। तो इन विवो इमेजिंग तकनीक क्या है?

1. इन विवो इमेजिंग तकनीक क्या है?
2. ल्यूसिफ़रेज़ इमेजिंग की विशेषताएं
3. ल्यूसिफ़रेज़ इमेजिंग की अनुप्रयोग दिशा
4. प्रयोगात्मक उदाहरण साझा करना
5. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
6. उत्पाद जानकारी
7. पढ़ने के संबंध में

1. इन विवो इमेजिंग तकनीक क्या है?

1999 की शुरुआत में, संयुक्त राज्य अमेरिका में हार्वर्ड विश्वविद्यालय के डॉ. वीसलेडर ने आणविक इमेजिंग की अवधारणा का प्रस्ताव रखा, यानी सेलुलर और आणविक स्तरों पर जैविक प्रक्रियाओं पर गुणात्मक और मात्रात्मक अनुसंधान करने के लिए इमेजिंग विधियों का उपयोग करना। इन विवो इमेजिंग आणविक इमेजिंग पर आधारित है। इस इमेजिंग सिस्टम के माध्यम से, जीवित जानवरों में ट्यूमर वृद्धि और मेटास्टेसिस, संक्रामक रोगों के विकास और विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति जैसी जैविक प्रक्रियाओं को देखा जा सकता है।

जीवित प्राणियों की ऑप्टिकल इमेजिंग में मुख्य रूप से दो तकनीकें अपनाई जाती हैं: बायोलुमिनेसेंस और फ्लोरोसेंस। बायोलुमिनेसेंस कोशिकाओं या डीएनए को चिह्नित करने के लिए ल्यूसिफ़रेज़ जीन है, जबकि फ्लोरोसेंस तकनीक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन और रेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन और FITC, Cy5 और Cy7 जैसे फ्लोरोसेंस तत्वों और लेबलिंग के लिए क्वांटम डॉट्स (QD) का उपयोग करती है। स्तनधारी बायोलुमिनेसेंस आम तौर पर जुगनू ल्यूसिफ़रेज़ जीन (554 न्यूक्लियोटाइड्स से बना, लगभग 50KD), यानी ल्यूसिफ़रेज़ जीन को ल्यूसिफ़रेज़ को व्यक्त करने के लिए अपेक्षित अवलोकन कोशिका के गुणसूत्र डीएनए में एकीकृत करता है। फिर एक सेल लाइन की खेती करें जो ल्यूसिफ़रेज़ को स्थिर रूप से व्यक्त कर सके, और जब कोशिकाएँ विभाजित, विभेदित और स्थानांतरित होंगी, तो ल्यूसिफ़रेज़ भी स्थिर रूप से व्यक्त करना जारी रखेगा। जीन, कोशिकाएँ और जीवित जानवर सभी को ल्यूसिफ़रेज़ जीन के साथ टैग किया जा सकता है। लूसिफ़ेरेज़ एक प्रकार का एंजाइम है जो बायोल्यूमिनेसेंस उत्पन्न करने के लिए सब्सट्रेट को उत्प्रेरित कर सकता है। विभिन्न स्रोतों से लूसिफ़ेरेज़ की अपनी विशेषताएं होती हैं और वे प्रकाश के विभिन्न रंगों को उत्सर्जित करने के लिए सब्सट्रेट को उत्प्रेरित कर सकते हैं। उनमें से, जुगनू लूसिफ़ेरेज़ में उच्च संवेदनशीलता और 7 ~ 8 ऑर्डर ऑफ़ मैग्नीट्यूड की एक विस्तृत रैखिक सीमा होती है। यह सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला स्तनधारी सेल रिपोर्टर जीन बन गया है। लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर प्लास्मिड को कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था, और कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के लिए इसके सब्सट्रेट लूसिफ़ेरिन को जोड़ा गया था। एटीपी की उपस्थिति में, ओ₂, और मैग्नीशियम आयनों, ल्यूसिफ़रेज़ ल्यूसिफ़रिन सब्सट्रेट को ऑक्सीकरण कर सकता है जिससे एक दृश्य प्रकाश प्रतिक्रिया उत्पन्न होती है। "एक बार के 'ट्रैकर' इंस्टॉलेशन को साकार करें, और किसी भी समय ट्रैक और पता लगाएँ"। जुगनू ल्यूसिफ़रेज़ के अलावा, कभी-कभी रेनिला ल्यूसिफ़रेज़ का उपयोग किया जाता है। दोनों के सब्सट्रेट अलग-अलग हैं, पूर्व का सब्सट्रेट डी-लूसिफ़रिन है, और बाद का सब्सट्रेट कोएलेंटरज़ीन है। दोनों के प्रकाश उत्सर्जक तरंगदैर्ध्य अलग-अलग हैं, पूर्व द्वारा उत्सर्जित प्रकाश तरंगदैर्ध्य की सीमा 540-600nm है, और बाद के द्वारा उत्सर्जित प्रकाश तरंगदैर्ध्य की सीमा 460-540nm है। पूर्व द्वारा उत्सर्जित प्रकाश ऊतकों से गुजरना आसान है, जबकि बाद वाला शरीर में तेजी से चयापचय होता है, और इसकी विशिष्टता पूर्व की तरह अच्छी नहीं है। इसलिए, अधिकांश इन विवो प्रयोगों में रिपोर्टर जीन के रूप में जुगनू ल्यूसिफ़रेज़ का उपयोग नहीं किया जाता है।

चित्र 1.ल्यूसिफ़रेज़ लेबल वाली कोशिकाओं का स्थानीयकरण

बायोलुमिनेसेंस का ऑप्टिकल सिद्धांत: स्तनधारी ऊतकों में प्रसार करते समय प्रकाश बिखर जाएगा और अवशोषित हो जाएगा, और कोशिका झिल्ली और कोशिका द्रव्य का सामना करते समय फोटॉन अपवर्तित हो जाएंगे, और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं और ऊतकों में फोटॉन को अवशोषित करने की अलग-अलग विशेषताएं होती हैं। हीमोग्लोबिन शरीर में दृश्य प्रकाश के अवशोषण का मुख्य कारण है और दृश्य प्रकाश के अधिकांश नीले-हरे बैंड को अवशोषित कर सकता है। लेकिन 600nm से अधिक दृश्य प्रकाश के लाल प्रकाश बैंड में, हीमोग्लोबिन का अवशोषण बहुत कम होता है। इसलिए, लाल क्षेत्र में पता लगाने के लिए ऊतक और त्वचा से बड़ी मात्रा में प्रकाश गुजर सकता है। जीवित पशु बायोलुमिनसेंट इमेजिंग तकनीक का उपयोग करके कम से कम कुछ सौ चमड़े के नीचे की कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है। हालांकि, माउस में प्रकाश स्रोत की गहराई के आधार पर, देखी जा सकने वाली कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या भिन्न होती है। आम तौर पर, 1 सेमी की प्रत्येक वृद्धि के लिए, चमकदार तीव्रता 10 गुना कम हो जाती है, और रक्त में समृद्ध ऊतकों और अंगों के लिए क्षीणन अधिक होता है, और हड्डियों से सटे ऊतकों और अंगों के लिए कम क्षीणन होता है। समान गहराई के मामले में, ज्ञात प्रकाश तीव्रता का कोशिकाओं की संख्या के साथ एक महत्वपूर्ण रैखिक संबंध होता है, और ज्ञात प्रकाश तीव्रता को कोशिकाओं की संख्या को प्रतिबिंबित करने के लिए उपकरण द्वारा परिमाणित किया जा सकता है।

चित्र 2. ल्यूसिफ़रेज़ और ल्यूसिफ़रिन पोटेशियम नमक प्रतिक्रिया का ल्यूमिनसेंट सिद्धांत

बायोल्यूमिनेसेंस से अलग, फ्लोरोसेंस तकनीक लेबलिंग के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन या फ्लोरोसेंट डाई (फ्लोरोसेंट क्वांटम डॉट्स जैसे नए नैनो-लेबलिंग मटीरियल सहित) का उपयोग करती है। रिपोर्टर जीन, फ्लोरोसेंट प्रोटीन या डाई से फ्लोरोसेंस का उपयोग करके, इन विवो में एक जैविक प्रकाश स्रोत बनाया जा सकता है। बायोल्यूमिनेसेंस बिना किसी उत्तेजना प्रकाश स्रोत के जानवरों में ऑटोफ्लोरोसेंस है, जबकि इमेजिंग सिस्टम द्वारा इसका पता लगाने से पहले फ्लोरोसेंस को बाहरी उत्तेजना प्रकाश स्रोत द्वारा उत्तेजना की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट लेबल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसमें जानवर, कोशिकाएँ, सूक्ष्मजीव, एंटीबॉडी, दवाएँ, नैनोमटेरियल आदि शामिल हैं।

2. ल्यूसिफ़रेज़ इमेजिंग की विशेषताएं

◎ कोई विकिरण नहीं, जीवों के लिए लगभग हानिरहित।

◎ उत्तेजना के बिना बायोलुमिनेसेंस प्रकाश स्रोत।

◎ उच्च संवेदनशीलता, सैकड़ों कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है।

◎ अच्छी प्रवेश्यता, 3-4 सेमी ऊतक गहराई अभी भी पता लगाया जा सकता है।

◎ उच्च संकेत-से-शोर अनुपात, मजबूत प्रतिदीप्ति संकेत, और अच्छा विरोधी हस्तक्षेप।

3. ल्यूसिफ़रेज़ इमेजिंग की अनुप्रयोग दिशा

3.1 ट्यूमर की वृद्धि

नग्न चूहों पर किए गए ट्यूमरजनन प्रयोग में, ट्यूमर की वृद्धि को बिना किसी आक्रमण के वास्तविक समय में देखा गया, तथा माप के लिए ट्यूमर को हटाने की आवश्यकता नहीं पड़ी।

3.2 ओन्कोलॉजी दवाएं

ट्यूमर की वृद्धि या मेटास्टेसिस पर प्रशासन के प्रभाव का पता लगाया गया, और फ्लोरेसिन सब्सट्रेट को दवा प्रयोग में हस्तक्षेप किए बिना, 3 घंटे के भीतर समाप्त किया जा सका।

3.3 कोशिका स्थानीयकरण

पशुओं में विदेशी कोशिकाओं के स्थानीयकरण और वितरण का पता लगाया गया।

3.4 जीन अभिव्यक्ति विनियमन

दवा उपचार या रोग के दौरान जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाने के लिए लक्ष्य जीन या लक्ष्य जीन के प्रमोटर को ल्यूसिफ़रेज़ जीन के साथ जोड़ा गया।

3.5 स्टेम सेल अनुसंधान

स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यारोपण, उत्तरजीविता और प्रसार की निगरानी करना; स्टेम कोशिकाओं के वितरण और प्रवास का पता लगाना जीवित अवस्था में.

4. प्रयोग उदाहरण बंटवारे

चित्र तीन। जीवित अवस्था में CAR-MUC1 के चिकित्सीय प्रभाव का इमेजिंग पता लगाना टी/सीएआर-एमयूसी1-आईएल22 ट्यूमर निर्माण पर एचएन4 कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा टी कोशिकाएं चूहों^[1].

चित्र 4. HUC-MSCs कोशिकाओं को माउस कंकाल की मांसपेशी में इंजेक्ट करने के बाद, कोशिकाओं के स्थानीयकरण का पता लगाया गया जीवित अवस्था में इमेजिंग (लाल तीर से चिह्नित)^[2].

चित्र 5. की क्षमता जीवित अवस्था में मेसेनकाइमल स्टेम सेल (MSC) के जलने वाले स्थानों पर प्रवास का पता लगाने के लिए इमेजिंग। मेसेनकाइमल स्टेम सेल (MSC/FLuc) को माउस बैक बर्न मॉडल में अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया गया। इंजेक्शन के चार दिन बाद, जले हुए घाव के घायल स्थान पर बायोल्यूमिनेसेंस संकेत दिखाई दिए, और फिर धीरे-धीरे कम हो गए (लाल तीर जलने वाले स्थान को दर्शाता है)^[3].

5. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न

प्रश्न 1: पारंपरिक तकनीक की तुलना में बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग तकनीक के क्या फायदे हैं?

पारंपरिक तकनीक की तुलना में, यह तकनीक ट्यूमर मेटास्टेसिस, जीन थेरेपी, महामारी विज्ञान, स्टेम सेल ट्रेसिंग, ल्यूकेमिया और अन्य संबंधित अनुसंधान के पारंपरिक तरीकों की तुलना में अधिक संवेदनशील है। यह ट्रांसजेनिक पशु रोग मॉडल की एक श्रृंखला के माध्यम से संबंधित रोगों के रोगजनन और दवा स्क्रीनिंग का त्वरित और सहज अध्ययन भी कर सकता है।

प्रश्न 2: ल्यूसिफ़रेज़ जीन के साथ स्टेम कोशिकाओं को कैसे लेबल किया जाए?

संवैधानिक रूप से व्यक्त जीन को ट्रांसजेनिक चूहे बनाने के लिए लेबल किया जा सकता है, और स्टेम सेल को लेबल किया जाता है। हेमेटोपोएटिक स्टेम सेल को चूहे की अस्थि मज्जा से लिया जाता है और दूसरे चूहे की अस्थि मज्जा में प्रत्यारोपित किया जाता है। इस तकनीक का उपयोग शरीर में हेमेटोपोएटिक स्टेम कोशिकाओं के प्रसार, विभेदन और प्रवास का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। एक अन्य विधि स्टेम कोशिकाओं को लेंटिवायरस के साथ लेबल करना है।

प्रश्न 3: फ्लोरेसिन इंजेक्शन के बाद कितने समय तक परीक्षण करना उचित है, और चमक कितने समय तक बनी रह सकती है?

आम तौर पर, प्रतिदीप्ति संकेत 10-15 मिनट के लिए इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के बाद सबसे मजबूत स्थिर अवधि तक पहुँच जाता है और 20-30 मिनट के बाद क्षय होना शुरू हो जाता है। 3 घंटे के बाद, फ्लोरेसिन समाप्त हो जाता है और ल्यूमिनेसेंस पूरी तरह से गायब हो जाता है।

प्रश्न 4: चूहों में फ्लोरेसिन का इंजेक्शन कैसे लगाया जाता है? इंजेक्शन के तरीकों में क्या अंतर है?

फ्लोरेसिन को चूहों में इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन या टेल वेन इंजेक्शन द्वारा इंजेक्ट किया जा सकता है। यह लगभग 1 मिनट में चूहों के पूरे शरीर में फैल सकता है। अधिकांश मामलों में, फ्लोरेसिन की सांद्रता 150 मिलीग्राम/किलोग्राम होती है। 20 ग्राम चूहों के लिए, लगभग 3 मिलीग्राम फ्लोरेसिन का उपयोग किया जा सकता है। इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के लिए, प्रसार धीमा होता है, प्रारंभिक चमक धीमी होती है, और निरंतर चमक का समय लंबा होता है। फ्लोरेसिन के टेल वेन इंजेक्शन के लिए, यह जल्दी से फैलता है और जल्दी से प्रकाश उत्सर्जित करना शुरू कर देता है, लेकिन चमक की अवधि कम होती है।

6.उत्पाद की जानकारी

येसेन एक जैव प्रौद्योगिकी कंपनी है जो तीन प्रमुख जैविक अभिकर्मकों: अणुओं, प्रोटीन और कोशिकाओं के अनुसंधान, विकास, उत्पादन और बिक्री में लगी हुई है। येसेन द्वारा प्रदान किए जाने वाले उत्पाद इस प्रकार हैं।

तालिका 1. उत्पाद जानकारी

7. पढ़ने के संबंध में

ल्यूसिफ़रेज़ रिपोर्टर जीन डिटेक्शन सिस्टम की एक नई पीढ़ी - अधिक आसान, अधिक संवेदनशील, अधिक सटीक