ऑरियोबैसिडिन ए क्या है?
ऑरियोबैसिडिन ए (एबीए) एक चक्रीय पेप्टाइड एंटीबायोटिक है जिसे फिलामेंटस फंगस ऑरियोबैसिडियम पुलुलेंस नंबर R106 से अलग किया गया है, जिसमें मजबूत एंटीफंगल गुण होते हैं और कम सांद्रता (0.1-0.5 μg/mL) पर खमीर के लिए विषाक्त हो सकते हैं। AbA की क्रियाविधि इनोसिटोल फॉस्फोरिलसेरामाइड सिंथेस (IPC सिंथेस) की गतिविधि के अवरोध के माध्यम से होती है, जो खमीर में AUR1 जीन द्वारा एन्कोड किया गया एक एंजाइम है, जो सेरामाइड से इनोसिटोल फॉस्फोलिपिड्स के संश्लेषण को अवरुद्ध करता है, जिससे स्फिंगोलिपिड्स की कमी होती है, कोशिका झिल्ली का टूटना होता है, और इस प्रकार स्ट्रेन मर जाता है। AbA के प्रति संवेदनशील फंगल प्रजातियों में सैक्रोमाइसिस सेरेविसिया, स्किज़ोसैक्रोमाइसिस पोम्बे, कैंडिडा ग्लाब्रेटा, एस्परगिलस निडुलन्स और ए. नाइजर शामिल हैं।
चित्र 1 AbA का संरचनात्मक सूत्र, CAS#127785-64-2
शोध में पाया गया है कि सैकरोमाइसिस सेरेविसिया का AUR1 जीन और एस्परगिलस निडुलन्स का AURA जीन समजातीय हैं, दोनों ही IPC सिंथेस को एनकोड करते हैं। इसलिए, इन दोनों जीनों में उत्परिवर्तन, उत्परिवर्तित जीन AUR1-C जैसे उपभेदों के लिए मजबूत AbA प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं। AbA सकारात्मक क्लोन की स्क्रीनिंग के लिए एक दवा चयन मार्कर के रूप में बहुत उपयुक्त है, और इसके लिए बहुत कम पृष्ठभूमि के साथ स्थिति अनुकूलन की आवश्यकता नहीं होती है। AbA प्रतिरोध यीस्ट सिंगल/डबल हाइब्रिड अध्ययनों के लिए भी एक आदर्श रिपोर्टर है और इसी प्रतिरोध को ले जाने वाले यीस्ट हाइब्रिड सिस्टम के साथ संगत है।
यीस्ट सिंगल/डबल हाइब्रिड सिस्टम क्या है
यीस्ट टू-हाइब्रिड सिस्टम (यीस्ट टू-हाइब्रिड परख) को फील्ड्स और सॉन्ग तथा अन्य लोगों द्वारा यूकेरियोटिक ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन की विशेषताओं के आधार पर बनाया गया था। यह ज्ञात प्रोटीनों के बीच अंतःक्रियाओं का त्वरित और प्रत्यक्ष विश्लेषण कर सकता है और इसका व्यापक रूप से एंटीजन-एंटीबॉडी अंतःक्रियाओं के अध्ययन, नए प्रोटीनों और नए प्रोटीन कार्यों की खोज, दवा लक्ष्यों की जांच और जीनोमिक प्रोटीन लिंकेज मानचित्रों की स्थापना में उपयोग किया जाता है। यीस्ट टू-हाइब्रिड का सिद्धांत यह है कि यूकेरियोट्स के ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर में दो अलग-अलग संरचनात्मक डोमेन होते हैं: डीएनए बाइंडिंग डोमेन (डीएनए बाइंडिंग डोमेन, डीएनए-बीडी) और डीएनए ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेशन डोमेन (एक्टिवेशन डोमेन, एडी), जिन्हें एक-दूसरे के कार्य को प्रभावित किए बिना स्वतंत्र रूप से अलग किया जा सकता है। बीडी और एडी अकेले ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया को सक्रिय नहीं कर सकते हैं, केवल जब दोनों स्थानिक रूप से काफी करीब होते हैं, तो वे एक पूर्ण ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर की गतिविधि प्रदर्शित करते हैं, जिससे डाउनस्ट्रीम जीन को ट्रांसक्रिप्ट किया जा सकता है। अध्ययनाधीन दो प्रोटीनों (प्रोटीन एक्स और प्रोटीन वाई) के क्रमशः BD और AD डोमेन के साथ संलयन प्लास्मिड का निर्माण करके और उन्हें एक ही यीस्ट कोशिका में व्यक्त करके, यदि दो प्रोटीनों के बीच कोई अंतःक्रिया नहीं होती है, तो रिपोर्टर जीन का प्रतिलेखन नहीं होगा; यदि दो प्रोटीन अंतःक्रिया करते हैं, तो BD और AD डोमेन स्थानिक रूप से करीब होंगे, इस प्रकार रिपोर्टर जीन का प्रतिलेखन हो जाएगा।
चित्र 2 यीस्ट दो-संकर का सिद्धांत आरेख [1]
यीस्ट वन-हाइब्रिड तकनीक न्यूक्लिक एसिड-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण है, जिसे यीस्ट टू-हाइब्रिड के आधार पर विकसित किया गया है, और इसका व्यापक रूप से यूकेरियोटिक कोशिकाओं में जीन के अभिव्यक्ति विनियमन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे कि यह पहचानना कि क्या ज्ञात डीएनए और ज्ञात प्रोटीन के बीच कोई इंटरैक्शन है; नए प्रोटीन को अलग करना जो लक्ष्य सीआईएस-नियामक तत्व या अन्य लघु डीएनए बाइंडिंग साइटों से जुड़ते हैं; डीएनए बाइंडिंग साइटों को सटीक रूप से ढूंढना जो प्रोटीन के डीएनए बाइंडिंग डोमेन का विश्लेषण करने और विश्लेषण करने के लिए सिद्ध हो चुके हैं। इसका मूल सिद्धांत सबसे बुनियादी प्रमोटर (न्यूनतम प्रमोटर, Pmin) के अपस्ट्रीम में ज्ञात सीआईएस-एक्टिंग तत्व का निर्माण करना और Pmin के डाउनस्ट्रीम में रिपोर्टर जीन को जोड़ना है। परीक्षण किए जाने वाले प्रतिलेखन कारक को एन्कोड करने वाले cDNA को यीस्ट AD डोमेन अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ जोड़ा जाता है और यीस्ट कोशिकाओं में पेश किया जाता है।यदि इस जीन का उत्पाद सिस-एक्टिंग तत्व से बंध सकता है, तो यह पीमिन प्रमोटर को सक्रिय कर सकता है, जिससे रिपोर्टर जीन को व्यक्त किया जा सकता है।
चित्र 3 यीस्ट एक-संकर का सिद्धांत आरेख [2]
यीस्ट सिंगल/डबल हाइब्रिड अध्ययनों के लिए, येसेन उत्पाद प्रदान करता है 60231ES ऑरियोबैसिडिन ए (AbA), ≥ 97% की शुद्धता और 1 mg/mL की सांद्रता के साथ मेथनॉल में घुला हुआ AbA का घोल। येसेन यीस्ट सिंगल/डबल हाइब्रिड प्रयोगों में 100-1000 ng/mL की AbA निरोधक सांद्रता की अनुशंसा करते हैं, और विशिष्ट कार्यशील सांद्रता मेजबान कोशिकाओं की संवेदनशीलता पर निर्भर करती है (निम्न तालिका देखें, विभिन्न यीस्ट उपभेदों के लिए AbA की न्यूनतम निरोधक सांद्रता (MIC))।
| बीजीवाणु तनाव | एमआईसी (एनग्राम/एमएल) | |
| एस.सेरेविसी | एटीसीसी9763 (द्विगुणित) | 200-400 |
| एसएच3328 (अगुणित) | 100 | |
| सेक खमीर (द्विगुणित) | 100-200 | |
| शोचू खमीर (द्विगुणित) | 100 | |
| बियर खमीर (ट्रिप्लोइड या टेट्राप्लोइड) | 100 | |
| बेकर का खमीर (द्विगुणित) | 200-400 | |
| स्किज़ो.पोम्बे | जेवाई-745 (मोनोप्लोइड) | 100 |
| सी.एल्बिकेन्स | टीआईएमएम-0136 (द्विगुणित) | 40 |
| सी.ट्रॉपिकलिस | टीआईएमएम-0324 (द्विगुणित) | 80 |
आवेदन मामला
GmSAGT1 जीन के प्रमोटर पर GmWRKY31 प्रोटीन की बाइंडिंग साइट का अध्ययन करने के लिए, यीस्ट वन-हाइब्रिड प्रयोग में, लक्ष्य डीएनए अनुक्रम को pBait-AbAi वेक्टर में डाला गया था जिसमें यूरेसिल रिपोर्टर जीन Ura3 था, जो AUR1-C जीन के अपस्ट्रीम में स्थित था। संबंधित प्लास्मिड के साथ यीस्ट रूपांतरण के बाद, इसे 0.9% NaCl घोल में निलंबित कर दिया गया था, और OD600 को 0.005 पर समायोजित किया गया था। इसके बाद, नमूने के 100 μL को 500 ng/mL AbA युक्त प्लेटों पर फैलाया गया, उल्टा किया गया, और 3-5 दिनों के लिए 30℃ पर संवर्धित किया गया[3].
चित्र 3 GmWRKY31 प्रोटीन की F16, F20, F73, delF16, delF20, या delF73 टुकड़ों वाले यीस्ट उपभेदों के साथ अंतःक्रिया।
हमारे अभिकर्मकों के साथ प्रकाशित लेख
[1] शुनान झांग, युयी झांग, कांगनिंग ली,, एट अल. नाइट्रोजन चावल में पुष्प विनियामकों के माध्यम से फूल आने के समय और नाइट्रोजन उपयोग दक्षता को नियंत्रित करता है, वर्तमान जीवविज्ञान, खंड 31, अंक 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (अगर:10.834)
[2] जियायिंग कुआंग, यिंगचुन जू, यिदान लियू, एट अल. कमल में फूलों की छाया-प्रेरित प्रारंभिक समाप्ति का एक एनएनएसएनआरके1-केंद्रित विनियामक नेटवर्क, पर्यावरण और प्रायोगिक वनस्पति विज्ञान, खंड 221,2024,105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (अगर:5.7)
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संदर्भ दस्तावेज़
[1] पियानो ए, एट अल. इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान करने के लिए यीस्ट टू-हाइब्रिड परख.कर्र प्रोटोक प्रोटीन विज्ञान. 2019 फरवरी;95(1):e70.
[2] जॉन एस, एट अल. यीस्ट वन-हाइब्रिड एसेज़: एक ऐतिहासिक और तकनीकी परिप्रेक्ष्य. विधियाँ. 2012 अगस्त;57(4): 441-447.
[3] डोंग एच, एट अल. पेरोनोस्पोरा मैनशूरिका संक्रमण के जवाब में सोयाबीन WRKY TFs का ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण। जीनोमिक्स। 2019 दिसंबर;111(6):1412-1422।