1 एकार्रवाई सिद्धांत
हाइग्रोमाइसिन बी एक एमिनोग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक है, जो स्ट्रेप्टोमाइसेस हाइग्रोस्कोपिकस के चयापचय द्वारा निर्मित होता है, जो स्थानांतरण को बाधित करके और 80 एस राइबोसोम की गलत व्याख्या को बढ़ावा देकर प्रोटीन संश्लेषण को रोकता है, जिससे प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक कोशिकाएं नष्ट हो जाती हैं।
वर्तमान में, इसका उपयोग आमतौर पर हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध जीन युक्त प्रोकैरियोटिक या यूकेरियोटिक कोशिकाओं की जांच और रखरखाव के लिए किया जाता है।
2 आवेदन
2.1 प्रोकैरियोटिक या यूकेरियोटिक कोशिकाओं (पौधे की कोशिकाओं और स्तनधारी कोशिकाओं) की स्क्रीनिंग और रखरखाव, जो एचपीएच के साथ स्थिर रूप से संक्रमित हों+वैक्टरहाइग्रोमाइसिन बी प्रतिरोध जीन (hyg या hph) एस्चेरिचिया कोली से व्युत्पन्न है। यह हाइग्रोमाइसिन बी फॉस्फोट्रांस्फरेज को एनकोड करता है, जो हाइग्रोमाइसिन बी को जैविक रूप से निष्क्रिय फॉस्फोराइलेटेड उत्पाद में परिवर्तित करता है, जिससे विषहरण होता है। इस सिद्धांत के मद्देनजर, हाइग्रोमाइसिन बी एक बहुत ही उपयोगी चयन योग्य मार्कर है जो हाइग्रोमाइसिन प्रतिरोध जीन के साथ सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट किए गए सुसंस्कृत प्रोकैरियोटिक या यूकेरियोटिक कोशिकाओं को स्क्रीन और बनाए रखने के लिए है।
2.2क्रिया के तरीके में अंतर के कारण, हाइग्रोमाइसिन बी का उपयोग अक्सर जेनेटिकिन जी418, ब्लियोमाइसिन और ब्लास्टिसिडिन के साथ संयोजन में किया जाता है ताकि दो अलग-अलग वैक्टरों के साथ स्थिर रूप से ट्रांसफ़ेक्ट की गई सेल लाइनों की जांच की जा सके।हाइग्रोमाइसिन बी की क्रियाविधि G418 (कैट#60220ES), ब्लिओमाइसिन (कैट#60257ES) से भिन्न है। और ब्लास्टीसिडिन्स (कैट#60218ES), इसलिए यह दोहरे चयन प्रयोगों में अन्य चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ संयोजन में उपयोग के लिए उपयुक्त है।
2.3 एंटीवायरल एजेंट2.4 कृमिनाशक के रूप में इसे पशु आहार में मिलाया जाता है, तथा पशुओं को पाला जाता है।
2.5 स्थिर रूप से संक्रमित कोशिकाओं की जांच
स्थिर ट्रांसफेक्टेंट्स की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले हाइग्रोमाइसिन बी की कार्यशील सांद्रता कोशिका के प्रकार, माध्यम, वृद्धि की स्थिति और कोशिका चयापचय दर के आधार पर भिन्न होती है। अनुशंसित सांद्रता 50-1000 μg/mL है। प्रायोगिक प्रणाली के पहले उपयोग के लिए यह अनुशंसा की जाती है कि इष्टतम स्क्रीनिंग सांद्रता को किल कर्व, यानी खुराक-प्रतिक्रिया वक्र स्थापित करके निर्धारित किया जाए। सामान्य तौर पर, स्तनधारी कोशिकाओं के लिए 50-500 μg/mL; बैक्टीरिया/पौधे कोशिकाओं के लिए 20-200 μg/mL; कवक के लिए 200-1000 μg/mL।
3 प्रोटोकॉल
3.1 भंडारण समाधान की तैयारी (50 मिलीग्राम/एमएल)
0.5 ग्राम हाइग्रोमाइसिन बी का वजन करें और 10 एमएल 1×PBS, pH 7.4 मिलाएं। पूरी तरह से घुल जाने के बाद, स्टरलाइज़ेशन के लिए 0.22 μm फ़िल्टर से छान लें। स्टरलाइज़ किए गए घोल को अलग-अलग हिस्सों में बाँटें और -20℃ पर स्टोर करें।
3.2 आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली स्क्रीनिंग सांद्रता
स्थिर उपभेदों की जांच के लिए हाइग्रोमाइसिन बी की कार्यशील सांद्रता कोशिका प्रकार, संवर्धन माध्यम, वृद्धि की स्थिति और कोशिका चयापचय दर के अनुसार भिन्न होती है। पहली बार इष्टतम स्क्रीनिंग सांद्रता निर्धारित करने के लिए, एक मारक वक्र (खुराक-प्रतिक्रिया वक्र) स्थापित करने की सिफारिश की जाती है। सामान्यतः स्तनधारी कोशिकाएं: 50-500 μg/mL; जीवाणु/पौधे कोशिकाएं: 20-200 μg/mL; कवक: 300-1000 μg/mL.
3.3 मारक वक्र की स्थापना
【नोट】स्थिर कोशिका रेखाओं की स्क्रीनिंग के लिए, संक्रमित मेजबान कोशिकाओं को मारने में सक्षम एंटीबायोटिक दवाओं की न्यूनतम सांद्रता निर्धारित करना आवश्यक है। इसे मारने वाले वक्र (खुराक-प्रतिक्रिया वक्र) की स्थापना करके प्राप्त किया जा सकता है। कम से कम पाँच सांद्रता की व्यवस्था की जानी चाहिए।
1) दिन 1: अपरिवर्तित कोशिकाओं को 20-25% कोशिका घनत्व पर एक उपयुक्त संवर्धन प्लेट में रखा जाता है और रात भर संवर्धित किया जाता है।【नोट】जीवन शक्ति का पता लगाने के लिए उच्च घनत्व की आवश्यकता वाले कोशिकाओं के लिए टीकाकरण कोशिकाओं की मात्रा बढ़ाई जा सकती है।
2)सेल प्रकार के अनुसार उचित सीमा के भीतर सांद्रता ढाल सेट करें। स्तनधारी कोशिका 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL सेट कर सकती है। हाइग्रोमाइसिन बी घोल को 1:10 अनुपात में विआयनीकृत पानी या पीबीएस बफर के साथ 5 मिलीग्राम/एमएल तक पतला करें। और फिर निम्न तालिका के अनुसार संबंधित कार्यशील सांद्रता के लिए घोल को पतला करें।
| अंतिम सांद्रता (μg/mL) | मध्यम मात्रा (एमएल) | 5 मिलीग्राम/एमएल हाइग्रोमाइसिन बी की अतिरिक्त मात्रा (एमएल) |
| 50 | 9.9 | 0.1 |
| 100 | 9.8 | 0.2 |
| 250 | 9.5 | 0.5 |
| 500 | 9.0 | 1.0 |
| 750 | 8.5 | 1.5 |
| 1000 | 8.0 | 2.0 |
3) दिन 2: दवा की संगत सांद्रता वाले ताज़ा तैयार माध्यम से बदलें। प्रत्येक सांद्रता के लिए तीन समानांतर नमूने बनाएँ।
4) हर 3-4 दिन में दवा युक्त ताजा माध्यम से बदलें।
5) जीवित कोशिकाओं की गणना एक निश्चित चक्र (जैसे, हर 2 दिन) पर की जाती है ताकि संक्रमित कोशिकाओं की वृद्धि को रोकने के लिए उचित सांद्रता निर्धारित की जा सके। स्थिर सेल लाइन की स्क्रीनिंग के लिए कार्यशील सांद्रता के रूप में न्यूनतम सांद्रता चुनें जो आदर्श दिनों (आमतौर पर 7-10 दिन) के भीतर अधिकांश कोशिकाओं को मार देती है।
3.4 स्थिर ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाओं की स्क्रीनिंग
1) ट्रांसफ़ेक्शन के 48 घंटे बाद, कोशिकाओं को उचित सांद्रता (प्रत्यक्ष या पतला) पर हाइग्रोमाइसिन बी युक्त स्क्रीनिंग माध्यम द्वारा उपसंस्कृत किया गया। 【नोट】एंटीबायोटिक्स सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं पर सबसे अच्छा काम करते हैं। यदि कोशिकाएँ बहुत सघन हैं, तो एंटीबायोटिक कोशिकाओं को नहीं मारेंगे। कोशिकाओं को इस तरह विभाजित करें कि कोशिकाएँ 25% से अधिक संलयित न हों।
2) स्क्रीनिंग माध्यम को हर 3-4 दिन में बदलें।
3) स्क्रीनिंग के 7 दिनों के बाद सेल कॉलोनी-गठन को मापें। होस्ट सेल के प्रकार, ट्रांसफ़ेक्शन और स्क्रीनिंग प्रभावशीलता के आधार पर कॉलोनी गठन में एक और सप्ताह या उससे अधिक समय लग सकता है।
4) 5-10 प्रतिरोधी क्लोन चुनें और उन्हें 35 मिमी सेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें, और 7 दिनों के लिए दवा युक्त स्क्रीनिंग माध्यम में संवर्धित करें।
5) संवर्धन के लिए दवाओं के बिना ताजा माध्यम से प्रतिस्थापित करें।
4 गुण
हाइग्रोमाइसिन बी एक विशेष गंध वाला सफेद से पीले भूरे रंग का पाउडर है, जो पानी, मेथनॉल, इथेनॉल आदि में आसानी से घुलनशील है, और कई कार्बनिक और अकार्बनिक एसिड के साथ आसानी से लवण बनाता है।
5 उत्पाद भंडारण
घोल को सीधे 2 ~ 8 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है और 6 महीने से अधिक समय तक संग्रहीत किया जा सकता है।
6 सावधानी
1) एचपीएच जीन से संक्रमित कोशिकाएं हाइग्रोमाइसिन के प्रति प्रतिरोधी होती हैं, तथा संक्रमित कोशिकाएं जीन को स्थिर रूप से या अस्थायी रूप से व्यक्त करती हैं।
2) हाइग्रोमाइसिन बी प्रतिरोध जीन (hyg या hph) अन्य प्रजातियों में भी पाया गया, जिसमें E. Coli के अतिरिक्त स्ट्रेप्टोमाइसेस हाइग्रोस्कोपिकस और क्लेबसिएला न्यूमोनिया शामिल हैं।
7 उत्पाद अनुशंसा
येसेन प्रदान हाइग्रोमाइसिन बी दो रूपों में, पाउडर (1 ग्राम/10 ग्राम, कैट#60225ईएस) और घोल (50 मिलीग्राम/एमएल, कैट#60224ईएस)।
| प्रोडक्ट का नाम | बिल्ली# | विनिर्देश |
| हाइग्रोमाइसिन बी (50 मिलीग्राम/एमएल) | 60224ES03 | 1 ग्राम (20 एमएल) |
| 60224ईएस10 | 10×1 ग्राम (20 एमएल) | |
| हाइग्रोमाइसिन बी | 60225ES03 | 1 ग्राम |
| 60225ईएस10 | 10 ग्राम |
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