एपोप्टोसिस आम तौर पर एक तरह की प्रोग्राम्ड सेल डेथ को संदर्भित करता है जो कोशिकाओं के विकास के दौरान या कुछ कारकों की कार्रवाई के तहत इंट्रासेल्युलर जीन और उनके उत्पादों के विनियमन के माध्यम से होता है। एपोप्टोसिस भ्रूण के विकास और रूपजनन, ऊतकों में सामान्य कोशिका आबादी की स्थिरता, शरीर की रक्षा और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, बीमारी या विषाक्तता के कारण कोशिका क्षति और उम्र बढ़ने, और ट्यूमर की घटना और प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और इसका संभावित चिकित्सीय महत्व है।

एपोप्टोटिक मार्ग में घटनाएं एक समय अनुक्रम में घटित होती हैं, अर्थात, घटनाएं अनुक्रम में घटित होती हैं, और अंततः एपोप्टोटिक निकायों के उद्भव के साथ, एपोप्टोसिस की घटना होती है।

इसकी विशिष्ट विशेषताएं इस प्रकार हैं:

1. प्रारंभिक एपोप्टोसिस: कोशिका झिल्ली संरचना में परिवर्तन, फॉस्फेटिडिलसेरिन का अपवर्तन;

2. प्रारंभिक और मध्य चरण एपोप्टोसिस: साइटोप्लाज्म का घनत्व बढ़ गया, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता गायब हो गई, पारगम्यता बदल गई, और साइटोक्रोम सी को साइटोप्लाज्म में जारी किया गया;

3. देर से एपोप्टोसिस: एपोप्टोसिस सिग्नल ट्रांसडक्शन;

4. देर से एपोप्टोसिस: डीएनए 180~200bp टुकड़े के आकार तक विघटित हो गया।

चित्र 1: एपोप्टोसिस मार्ग में अनुक्रमिक घटनाओं की घटना और पता लगाना

1. प्रारंभिक एपोप्टोसिस: एनेक्सिन-वी/पीआई दोहरा अभिरंजन (बाह्यकोशिकीय झिल्ली पर PS का पता लगाना)

सामान्य जीवित कोशिकाओं में, फॉस्फेटिडिलसेरिन (PS) कोशिका झिल्ली के अंदरूनी हिस्से में स्थित होता है। जब एपोप्टोसिस होता है, तो कोशिका झिल्ली बदल जाती है, और PS कोशिका झिल्ली की आंतरिक सतह से कोशिका झिल्ली की बाहरी सतह पर आ जाता है। एनेक्सिन-V एक Ca2+ आश्रित फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन है जिसका आणविक भार 35-36 KD है, जो PS के साथ उच्च आत्मीयता के साथ बंध सकता है। फ्लोरेसिन (FITC, एलेक्सा फ्लोर488, आदि) के साथ लेबल किए गए एनेक्सिन-V का उपयोग जांच के रूप में करने से, एपोप्टोटिक कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं की पहचान फ्लो साइटोमेट्री या फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप द्वारा की जा सकती है।

नेक्रोटिक कोशिकाओं का PS भी कोशिका झिल्ली की आंतरिक सतह से कोशिका झिल्ली की बाहरी सतह पर बदल जाएगा। एनेक्सिन-V नेक्रोटिक कोशिकाओं की सतह पर PS को भी पहचान सकता है, इसलिए एनेक्सिन-V नेक्रोटिक कोशिकाओं को एपोप्टोटिक कोशिकाओं से अलग नहीं कर सकता है। इसके अलावा, प्रोपिडीन आयोडाइड (PI) एक न्यूक्लिक एसिड डाई है, जो कोशिकाओं में DNA से बंध सकता है, और यह पूरी कोशिका झिल्ली में प्रवेश नहीं कर सकता है। प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली अभी भी बरकरार है, और PI डाई DNA से बंध कर कोशिका झिल्ली के माध्यम से स्वतंत्र रूप से कोशिका में प्रवेश नहीं कर सकती है, इसलिए PI डाई एपोप्टोटिक कोशिकाओं और जीवित कोशिकाओं को लेबल नहीं कर सकती है, लेकिन PI डाई नेक्रोटिक कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली के माध्यम से कोशिका में DNA से बंध सकती है। मृत कोशिकाओं में PI डाई 488nm लेजर द्वारा उत्तेजित होने के बाद लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करेगी, और संबंधित चैनल द्वारा प्राप्त की जाएगी। इसलिए, एनेक्सिन V और PI का उपयोग जीवित कोशिकाओं, प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं और नेक्रोटिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक साथ किया जा सकता है।

चित्र 2: एनेक्सिन-वी/पीआई डबल स्टेनिंग के बाद फ्लो साइटोमेट्री परिणामों का विश्लेषण

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2. प्रारंभिक एपोप्टोसिस: जेसी-1 धुंधलापन (माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन का पता लगाना)

एपोप्टोसिस की प्रक्रिया अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता के विनाश के साथ होती है, जिसे व्यापक रूप से एपोप्टोसिस कैस्केड की प्रक्रिया में सबसे शुरुआती घटनाओं में से एक माना जाता है। यह परमाणु एपोप्टोसिस (क्रोमेटिन सांद्रता, डीएनए टूटना) की विशेषताओं के प्रकट होने से पहले होता है। एक बार जब माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता ढह जाती है, तो सेल एपोप्टोसिस अपरिवर्तनीय हो जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता का अस्तित्व कुछ लिपोफिलिक कैशनिक फ्लोरोसेंट रंगों जैसे कि रोडामाइन 123, जेसी-1, जेसी-10 को माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स से बांधने में सक्षम बनाता है। उनके प्रतिदीप्ति की वृद्धि या कमी माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली की विद्युत ऋणात्मकता की वृद्धि या कमी को इंगित करती है।

जेसी-1 का व्यापक रूप से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता △ΨM का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया में क्षमता-निर्भर संचय को दर्शाता है। सामान्य माइटोकॉन्ड्रिया में, जेसी-1 माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में एकत्रित होकर एक बहुलक बनाता है, जो मजबूत लाल प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है (एक्स = 585 एनएम, ईएम = 590 एनएम); एपोप्टोटिक कोशिकाओं में, माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसमेम्ब्रेन क्षमता विध्रुवित हो गई, जेसी-1 माइटोकॉन्ड्रिया से मुक्त हो गया, सांद्रता कम हो गई, और हरे प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करने वाले मोनोमर रूप में परिवर्तित हो गई। इसलिए, रंग का परिवर्तन सीधे तौर पर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन को दर्शाता है। माइटोकॉन्ड्रियल विध्रुवीकरण की डिग्री को लाल/हरे प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुपात से भी मापा जा सकता है। जेसी-1 का पता लगाना एक सामान्य विधि है।

3. लेट एपोप्टोसिस: ट्यूनल विधि (डीएनए खंड इन सीटू लेबलिंग विधि)

एपोप्टोसिस के अंतिम चरण में, क्रोमोसोमल डीएनए के डबल स्ट्रैंड ब्रेक या सिंगल स्ट्रैंड ब्रेक के कारण बड़ी संख्या में चिपचिपे 3-OH टर्मिनल बनते हैं। डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड टर्मिनल ट्रांसफ़ेरेज़ (TdT) की क्रिया के तहत, ल्यूसिफ़रेज़ लेबल वाले dUTP को डीएनए के 3-टर्मिनल से बांधा जा सकता है, ताकि एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता लगाया जा सके, ऐसे तरीकों को टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्रांसफ़ेरेज़ मीडिएटेड dUTP निक एंड लेबलिंग (TUNEL) कहा जाता है। क्योंकि सामान्य या प्रोलिफ़रेटिंग कोशिकाओं में लगभग कोई डीएनए ब्रेक नहीं होता है, इसलिए कोई 3-OH गठन नहीं होता है और कुछ को दाग दिया जा सकता है। TUNEL वास्तव में आणविक जीव विज्ञान और आकृति विज्ञान को मिलाने वाली एक शोध पद्धति है। एक पूर्ण एकल एपोप्टोटिक नाभिक या एपोप्टोटिक शरीर का इन सीटू धुंधलापन एपोप्टोसिस की विशिष्ट जैव रासायनिक और रूपात्मक विशेषताओं को सटीक रूप से दर्शा सकता है। इसका उपयोग पैराफिन एम्बेडेड ऊतक वर्गों, जमे हुए ऊतक वर्गों, सुसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतकों से अलग कोशिकाओं की कोशिका आकृति विज्ञान को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, और बहुत कम संख्या में एपोप्टोटिक कोशिकाओं का पता लगा सकता है, इसलिए, इसका व्यापक रूप से एपोप्टोसिस के अध्ययन में उपयोग किया जाता है।

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