विवरण
जब कोशिकाएं एपोप्टोसिस से गुजरती हैं, तो वे एंडोन्यूक्लिएज एंजाइम को सक्रिय करती हैं जो न्यूक्लियोसोम के बीच जीनोमिक डीएनए को काटती हैं। एपोप्टोसिस के दौरान डीएनए निष्कर्षण के बाद इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा 180-200bp की डीएनए सीढ़ी का पता लगाया गया।
ट्यूनल (TdT मध्यस्थता dUTP निक एंड लेबलिंग) एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट (एलेक्सा फ्लुअर 488) का उपयोग ऊतक कोशिकाओं की देर से होने वाली अपोप्टोसिस प्रक्रिया में परमाणु डीएनए विखंडन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। सिद्धांत यह है कि टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइडिल ट्रांसफ़ेरेस (TdT) की क्रिया के तहत, एलेक्सा फ्लुअर 488-12-DUTP को जीनोमिक डीएनए ब्रेक के दौरान उजागर 3´-हाइड्रॉक्सिल (3´-OH) टर्मिनल में शामिल किया जाता है। इस प्रकार, इसे फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी या फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया जा सकता है।
एलेक्सा फ्लोर 488 डाई अधिक स्थिर है और इसका सिग्नल अधिक मजबूत है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक चमकीले मार्कर और अधिक शमन प्रतिरोध होता है।
इस किट के अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है और इसका उपयोग जमे हुए या पैराफिन खंडों के साथ-साथ सुसंस्कृत आसंजक या निलंबित कोशिकाओं में एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
उत्पाद घटक
| अवयव |
| 40307ES20（20 टी） | 40307ES50（50 टी） | 40307ES60（100 टी） |
| 40307-ए | 5×संतुलन बफर | 750 μएल | 1.25 एमएल×2 | 1.25 एमएल×3 |
| 40307-बी | एलेक्सा फ्लोर 488-12-dUTP लेबलिंग मिक्स | 100 μएल | 250 μएल | 250 μएल×2 |
| 40307-सी | पुनः संयोजक टीडीटी एंजाइम | 20 μएल | 50 μएल | 50 μएल×2 |
| 40307-डी | प्रोटीनेज़ K(2 मिलीग्राम/एमएल) | 40 μएल | 100 μएल | 100 μएल×2 |
| 40307-ई | डीएनएसे I (1 U/μL) | 5 μएल | 12.5 μएल | 25 μएल |
| 40307-एफ | 10 × DNase I बफर MgCl2 के साथ | 100 μएल | 250 μएल | 500 μएल |
शिपिंग और भंडारण
घटकों को एक आइस पैक के साथ भेजा जाता है और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक संग्रहीत किया जा सकता है वर्ष।
चेतावनी
1. कोशिकाओं को धोने के लिए अपना स्वयं का पीबीएस तैयार करना आवश्यक है, गोलियों को सील करने के लिए एक प्रतिदीप्ति शमन समाधान, और फिक्सिंग के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड।
2. केवल अनुसंधान के लिए उपयोग!
निर्देश
1. नमूना तैयार करना
1.1 पैराफिन एम्बेडेड ऊतक अनुभाग
1.1.1.पैराफिन ऊतक खंडों को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ज़ाइलीन में डुबोया गया और पैराफिन को पूरी तरह से हटाने के लिए एक बार दोहराया गया।
1.1.2. खंडों को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में भिगोएँ और एक बार दोहराएं।
1.1.3. कमरे के तापमान पर, नमूनों को प्रत्येक बार 3 मिनट के लिए ग्रेडिएंट इथेनॉल (90, 80, 70%) में भिगोया गया।
1.1.4.पीबीएस के साथ धीरे से खंडों को धो लें और फ़िल्टर पेपर के साथ ग्लास स्लाइड पर नमूने के चारों ओर अतिरिक्त तरल को सावधानी से सोखें। इस मामले में, पैराफिन पेन या हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग नमूने के चारों ओर नमूना वितरण की रूपरेखा खींचने के लिए किया जा सकता है, जो डाउनस्ट्रीम पारगम्यता प्रसंस्करण और संतुलन लेबलिंग ऑपरेशन के लिए सुविधाजनक है। प्रयोग के दौरान नमूने को सूखने न दें। नमूने को गीला रखने के लिए संसाधित नमूने को गीले बॉक्स में रखें।
1.1.5.2 mg/mL प्रोटीनेज K घोल को 1:100 के अनुपात में PBS के साथ पतला किया गया जिससे अंतिम सांद्रता 20 μg/mL तक पहुँची।
1.1.6. 20 μg/mL की सांद्रता पर प्रोटीनेज K के 100 μL घोल को प्रत्येक नमूने में पूरी तरह से कवर करने के लिए जोड़ा गया और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया।
[नोट्स]: प्रोटीनेज K ऊतकों और कोशिकाओं को बाद के चरणों में धुंधला अभिकर्मकों के लिए पारगम्य बनने में मदद करता है। बहुत लंबा ऊष्मायन समय बाद के धुलाई चरणों में वाहक प्लेट से ऊतक वर्गों के गिरने का जोखिम बढ़ाएगा, जबकि बहुत कम ऊष्मायन समय अपर्याप्त पारगम्यता उपचार का कारण बन सकता है और लेबलिंग दक्षता को प्रभावित कर सकता है। बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रोटीनेज K के ऊष्मायन समय को अनुकूलित करना आवश्यक हो सकता है।
1.1.7.नमूने को 2-3 बार पीबीएस घोल से धोएँ, अतिरिक्त तरल को धीरे से हटाएँ, और स्लाइड पर नमूने के चारों ओर तरल को फ़िल्टर पेपर से सावधानीपूर्वक सोखें। संसाधित नमूने को नम रखने के लिए गीले बॉक्स में रखा जाता है।
1.2 ऊतक का जमा हुआ भाग
1.2.1. जमे हुए हिस्सों को निकालें और कमरे के तापमान पर वापस लाएँ। स्लाइड्स को 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड घोल (पीबीएस में घुला हुआ) में डुबोया गया और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए स्थिर और संवर्धित किया गया।
1.2.2. अतिरिक्त द्रव को धीरे से निकालें और फिल्टर पेपर का उपयोग करके कांच की स्लाइड पर नमूने के चारों ओर अतिरिक्त द्रव को सावधानीपूर्वक सोखें।
1.2.3. स्लाइडों को पी.बी.एस. घोल में डुबोया गया, कमरे के तापमान पर 15 मिनट तक रखा गया, तथा कुल 2 बार पुनः पी.बी.एस. से धोया गया।
1.2.4. अतिरिक्त तरल को धीरे से हटाएँ और नमूने के चारों ओर अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर के साथ ग्लास स्लाइड को सावधानी से ब्लॉट करें। इस मामले में, पैराफिन पेन या हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग नमूने के चारों ओर नमूना वितरण की रूपरेखा खींचने के लिए किया जा सकता है, जो डाउनस्ट्रीम पारगम्यता प्रसंस्करण और संतुलन लेबलिंग ऑपरेशन के लिए सुविधाजनक है। प्रयोग के दौरान, नमूने को सूखने न दें, और नमूने को गीला रखने के लिए संसाधित नमूने को गीले बॉक्स में रखें।
1.2.5. 2 mg/mL प्रोटीनेस K घोल को 1:100 के अनुपात में PBS के साथ पतला किया गया जिससे अंतिम सांद्रता 20 μg/mL प्राप्त हुई।
1.2.6. 20 μg/mL की सांद्रता पर प्रोटीनेज K के 100 μL घोल को प्रत्येक नमूने में पूरी तरह से ढकने के लिए मिलाया गया और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा गया।
[नोट्स]: प्रोटीनेज K ऊतकों और कोशिकाओं को बाद के चरणों में धुंधला अभिकर्मकों के लिए पारगम्य होने में मदद करता है। बहुत लंबा ऊष्मायन समय बाद के धुलाई चरणों में वाहक प्लेट से ऊतक वर्गों के गिरने का जोखिम बढ़ाएगा, जबकि बहुत कम ऊष्मायन समय अपर्याप्त पारगम्यता उपचार का कारण बन सकता है और लेबलिंग दक्षता को प्रभावित कर सकता है। यदि बेहतर परिणाम प्राप्त नहीं हुए तो प्रोटीनेज K के ऊष्मायन समय को अनुकूलित करना आवश्यक हो सकता है।
1.2.7. नमूने को पीबीएस घोल वाले खुले बीकर में 2-3 बार धोएँ।
[नोट्स]: सफाई चरण में नमूना छीलने के नुकसान से बचने के लिए, बोतल को धोने की नहीं, बल्कि सफाई के लिए कांच की स्लाइडों को 2-3 बार पीबीएस घोल में भिगोने की सिफारिश की जाती है।
1.2.8. अतिरिक्त द्रव को धीरे से निकालें और स्लाइड पर नमूने के चारों ओर द्रव को सावधानीपूर्वक सोखने के लिए फिल्टर पेपर का उपयोग करें।संसाधित नमूने की नमी को संरक्षित करने के लिए उसे गीले बॉक्स में रखा जाता है।
1.3 सेल क्रॉल शीट की तैयारी
आसंजक कोशिकाओं को चैम्बर स्लाइड्स के लैब-टेक पर संवर्धित किया गया। एपोप्टोसिस प्रेरण उपचार के बाद, स्लाइड्स को दो बार PBS से धोया गया।
1.4 कोशिका स्मीयर की तैयारी (उदाहरण के तौर पर पॉली-लाइसिन लेपित स्लाइड्स लेना)
1.4.1. कोशिकाओं को लगभग 2 × 107 कोशिकाओं / एमएल की सांद्रता पर पीबीएस में पुनः निलंबित किया गया, 50-100 μL सेल निलंबन को पॉली-लाइसिन लेपित स्लाइडों पर चूसा गया, और सेल निलंबन को एक साफ स्लाइड के साथ धीरे से फैलाया गया।
1.4.2. कोशिकाओं को स्थिर किया गया, और स्लाइडों को पीबीएस में 4% ताजा तैयार पैराफॉर्मलडिहाइड युक्त एक धुंधला टैंक में डुबोया गया और 25 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया।
1.4.3. स्लाइड्स को धोया गया, PBS में डुबोया गया, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दिया गया। फिर से PBS से धोएँ।
1.4.4. अतिरिक्त तरल को धीरे से हटाएँ और नमूने के चारों ओर अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फ़िल्टर पेपर से ग्लास स्लाइड को सावधानी से ब्लॉट करें। इस मामले में, डाउनस्ट्रीम पारगम्यता प्रसंस्करण और संतुलन लेबलिंग संचालन को सुविधाजनक बनाने के लिए नमूने के चारों ओर नमूने के वितरण को रेखांकित करने के लिए पैराफिन पेन या हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग किया जा सकता है। प्रयोग के दौरान, नमूने को सूखने न दें, और नमूने को गीला रखने के लिए संसाधित नमूने को गीले बॉक्स में रखें।
1.4.5. 2 mg/mL प्रोटीनेज K घोल को 1:100 के अनुपात में PBS के साथ पतला किया गया जिससे अंतिम सांद्रता 20 μg/mL प्राप्त हुई।
1.4.6. 20 μg/mL की सांद्रता पर प्रोटीनेज K के 100 μL घोल को प्रत्येक नमूने में मिलाया गया ताकि इसे पूरी तरह से ढक दिया जाए और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा जाए (इसे PBS में तैयार 0.2% ट्राइटन X-100 घोल में भी डुबोया जा सकता है और पारगम्यता उपचार के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है)।
[नोट्स]: प्रोटीनेज K ऊतकों और कोशिकाओं को बाद के चरणों में धुंधला अभिकर्मकों के लिए पारगम्य होने में मदद करता है। बहुत लंबा ऊष्मायन समय बाद के धुलाई चरणों में वाहक प्लेट से ऊतक वर्गों के गिरने का जोखिम बढ़ाएगा, जबकि बहुत कम ऊष्मायन समय अपर्याप्त पारगम्यता उपचार का कारण बन सकता है और लेबलिंग दक्षता को प्रभावित कर सकता है। यदि बेहतर परिणाम प्राप्त नहीं हुए तो प्रोटीनेज K के ऊष्मायन समय को अनुकूलित करना आवश्यक हो सकता है।
1.4.7. नमूने को 2-3 बार पीबीएस से धोएँ, अतिरिक्त तरल को धीरे से हटाएँ, और स्लाइड पर नमूने के चारों ओर तरल को फ़िल्टर पेपर से सावधानीपूर्वक सोखें। संसाधित नमूनों को गीले बॉक्स में रखा गया।
2. सकारात्मक नियंत्रण के DNase उपचार के लिए कदम
नमूना पारगमन के बाद, सकारात्मक नियंत्रण स्लाइड तैयार करने के लिए कोशिकाओं को DNase I से उपचारित किया गया। इस प्रक्रिया के कारण आमतौर पर अधिकांश कोशिकाएँ हरे प्रतिदीप्ति को दिखाने के लिए उपचारित किया गया।
[नोट्स]: स्थिर कोशिकाओं के Dnase I उपचार से गुणसूत्री DNA टूट जाता है, जिससे DNA के कई 3'-छोर बनते हैं जिन्हें लेबल किया जा सकता है।
2.1. 10 × DNase I बफर को 1:10 के अनुपात में विआयनीकृत जल के साथ पतला करें (प्रत्येक नमूने के लिए 200 µL 1 × DNase I बफर की आवश्यकता होती है, अर्थात, पतला करने के लिए 20 µL 10 × DNase I बफर और 180 µL विआयनीकृत जल की आवश्यकता होती है)। पारगम्य नमूने में 100 µl की एक बूंद डाली गई और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। 10 U/mL की अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए 1 × DNase I बफर के शेष 100 μL में 1 μL DNase I (1U/μL) मिलाएं।
2.2.द्रव को धीरे से निकाला गया, फिर 100 μL बफर जिसमें 10 U/mL DNase I था, मिलाया गया और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए रखा गया।
2.3.अतिरिक्त तरल पदार्थ को निकालने के लिए स्लाइड को टैप करें, और विआयनीकृत पानी के साथ डाई टैंक में स्लाइड को 3-4 बार अच्छी तरह से धो लें।
[नोट्स]: सकारात्मक नियंत्रण स्लाइडों के लिए एक अलग अभिरंजन टैंक का उपयोग किया जाना चाहिए, अन्यथा सकारात्मक नियंत्रण स्लाइडों पर अवशिष्ट DNase I प्रयोगात्मक स्लाइडों पर उच्च पृष्ठभूमि प्रस्तुत कर सकता है।
3. लेबलिंग और पता लगाना
3.1.संतुलन बफर (5 × संतुलन बफर) को 1:5 के अनुपात में विआयनीकृत जल से पतला किया जाता है (प्रत्येक नमूने के लिए 100μL 1 × संतुलन बफर की आवश्यकता होती है)।
3.2. क्षेत्र को पूरी तरह से संतुलित करने के लिए प्रत्येक नमूने में संतुलन बफर (100μL 1× संतुलन बफर) मिलाया गया और RT पर 10-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया। वैकल्पिक रूप से, यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइड संतुलित हैं, 1 x संतुलन बफर के साथ VAT में स्लाइड करें। कोशिकाओं को संतुलित करते समय बर्फ पर एलेक्सा फ्लुओर 488-12-DUTP लेबलिंग मिक्स को पिघलाएं, और तालिका 1 के अनुसार सभी प्रयोगों और वैकल्पिक सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त TdT ऊष्मायन बफर तैयार करें। 5 सेमी2 से कम क्षेत्र वाली एक मानक प्रतिक्रिया के लिए, मात्रा 50 μl है, और 50 μl को प्रयोगात्मक और सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं की संख्या से गुणा किया जाता है ताकि आवश्यक TdT ऊष्मायन बफर की कुल मात्रा निर्धारित की जा सके। बड़े सतह क्षेत्रों वाले नमूनों के लिए, अभिकर्मक की मात्रा आनुपातिक रूप से बढ़ाई जा सकती है।
तालिका 1 प्रयोगों और वैकल्पिक सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं के लिए तैयार किए गए टीडीटी ऊष्मायन बफर
| अवयव | मात्रा（μL/50 μL प्रणाली) |
| डीडीएच2ओ | 34 |
| 5×संतुलन बफर | 10 |
| एलेक्सा फ्लोर 488-12-dUTP लेबलिंग मिक्स | 5 |
| पुनः संयोजक टीडीटी एंजाइम | 1 |
[नकारात्मक नियंत्रण प्रणाली]: टीडीटी एंजाइम के बिना एक नियंत्रण ऊष्मायन बफर तैयार किया गया था और टीडीटी एंजाइम को ddH2O के साथ प्रतिस्थापित किया गया था।
3.3. 100 μl 1× संतुलन बफर के अधिकांश भाग को संतुलन वाले क्षेत्र के चारों ओर शोषक कागज़ से धोया गया और फिर 50 μl TdT ऊष्मायन बफर को कोशिकाओं के 5 cm2 क्षेत्र में जोड़ा गया। कोशिकाओं को सूखने न दें। इसके बाद, स्लाइड को प्रकाश से बचाकर रखना चाहिए।
3.4. अभिकर्मकों का समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं पर एक प्लास्टिक कवरस्लिप रखें, और गीले बॉक्स के तल पर पानी से भीगा हुआ एक पेपर तौलिया रखें। स्लाइड्स को गीले बॉक्स में रखा गया और 60 मिनट के लिए 37 ℃ पर इनक्यूबेट किया गया। गीले बॉक्स को प्रकाश से बचाने के लिए एल्युमिनियम फॉयल में लपेटें।
[नोट्स]: प्लास्टिक कवर ग्लास को इस्तेमाल से पहले आधा काटा जा सकता है। आसानी से हटाने और हेरफेर करने के लिए कवर ग्लास के किनारे को मोड़ें।
3.5. प्लास्टिक कवरस्लिप्स को हटा दिया गया, और खंडों को कमरे के तापमान पर पीबीएस घोल में 5 मिनट के लिए रखा गया। फिर खंडों को दो बार ताजा पीबीएस से धोया गया।
3.6. फिल्टर पेपर से नमूने के चारों ओर और पीछे PBS घोल को धीरे से पोंछें।
[नोट्स]: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए, स्लाइडों को एक बार पीबीएस से धोने के बाद, उन्हें 0.1% ट्राइटन एक्स-100 और 5 मिलीग्राम/एमएल बीएसए युक्त पीबीएस से 3 बार, प्रत्येक बार 5 मिनट के अंतराल पर धोया जा सकता है, ताकि मुक्त अप्रतिक्रियाशील मार्कर स्पष्ट और स्वच्छ हो सकें।
3.7. नमूनों को एक अभिरंजन टैंक में अभिरंजित किया गया था, और स्लाइडों को अंधेरे में पीआई समाधान (1 μg/mL, ताजा तैयार और पीबीएस के साथ पतला) युक्त अभिरंजन टैंक में डुबोया गया था और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए छोड़ दिया गया था। (वैकल्पिक): नमूनों को एक अभिरंजन टैंक में अभिरंजित किया गया था, और स्लाइडों को अंधेरे में डीएपीआई समाधान (2 μg/mL, ताजा तैयार और पीबीएस के साथ पतला) युक्त अभिरंजन टैंक में डुबोया गया था, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए छोड़ दिया गया था।
3.8.सैंपल को धोएँ, स्लाइड को डीआयनाइज्ड पानी में डुबोएँ और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए छोड़ दें। कुल तीन बार धोने के लिए दो बार दोहराएँ।
3.9. स्लाइड पर मौजूद अतिरिक्त पानी को सुखाया गया तथा नमूने को नम बनाए रखने के लिए नमूना क्षेत्र में 100 μl PBS मिलाया गया।
3.10. नमूनों का तुरंत फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण किया गया, और एक मानक फ्लोरोसेंस फ़िल्टर डिवाइस के साथ 520±20 एनएम पर हरा फ्लोरोसेंस देखा गया। PI का लाल फ्लोरोसेंस > 620 एनएम पर देखा गया, या नीला DAPI 460 एनएम पर देखा गया। यदि आवश्यक हो, तो स्लाइड को अंधेरे में 4 ° C पर रात भर संग्रहीत किया जा सकता है।
[नोट्स]: पीआई/डीएपीआई एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक दोनों कोशिकाओं को लाल/नीले रंग में रंग सकता है, और केवल एपोप्टोटिक नाभिक में एलेक्सा फ्लुओर 488-12-डीयूटीपी को शामिल किया गया और हरे रंग के प्रतिदीप्ति को स्थानीयकृत किया गया।
4. निलंबन कोशिकाओं का पता फ्लो साइटोमेट्री द्वारा लगाया गया
4.1. 3~5 × 106 कोशिकाओं को 4 ° C पर सेंट्रीफ्यूजेशन (300 × g) द्वारा दो बार PBS से धोया गया, 4 ° C पर 300 g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया, और फिर 0.5 mL PBS में पुन: निलंबित किया गया।
4.2. कोशिकाओं को स्थिर किया गया, और पीबीएस में तैयार 1% पैराफॉर्मेल्डिहाइड घोल के 5 एमएल को जोड़ा गया और 20 मिनट के लिए बर्फ पर रखा गया।
4.3. कोशिकाओं को 300 × g पर 4 ° C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया, और सुपरनेटेंट को हटा दिया गया और 5 mL PBS में फिर से लटका दिया गया। धुलाई को एक बार दोहराया गया और कोशिकाओं को 0.5 mL PBS के साथ फिर से लटका दिया गया।
4.4. कोशिकाओं को पारगम्य बनाया गया, और 5 एमएल बर्फ-पूर्व-शीतित 70% इथेनॉल मिलाया गया और 4 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को एक सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में संग्रहीत किया जा सकता है, या कोशिकाओं को पीबीएस में तैयार 0.2% ट्राइटन एक्स-100 घोल के साथ पारगम्य किया जा सकता है और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है।
4.5. कोशिकाओं को 300 × g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज किया गया और 5 mL PBS में फिर से निलंबित किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराया गया और 1 mL PBS में फिर से निलंबित किया गया।
4.6. 2×106 कोशिकाओं को 1.5-एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
4.7. इक्विलिब्रेशन को 10 मिनट के लिए 300×g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, और सुपरनेटेंट को हटा दिया गया और 80 μL 1×इक्विलिब्रेशन बफर के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
4.8. कोशिकाओं को संतुलित करते समय, एलेक्सा फ्लुओर 488-12-DUTP लेबलिंग मिक्स को बर्फ पर पिघलाया गया, और सभी प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त TdT ऊष्मायन बफर को तालिका 1 के अनुसार तैयार किया गया। 2×106 कोशिकाओं की एक मानक प्रतिक्रिया के लिए, मात्रा 50 μL है, और प्रतिक्रियाओं की संख्या का 50 μL गुना आवश्यक TdT ऊष्मायन बफर की कुल मात्रा है।
4.9. कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 300×g पर सेंट्रीफ्यूज किया गया, सतह पर तैरनेवाला पदार्थ हटा दिया गया और अवक्षेप को 50μL TdT ऊष्मायन बफर में फिर से निलंबित कर दिया गया और 37℃ पर 60 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया, प्रकाश से परिरक्षित किया गया। कोशिकाओं को हर 15 मिनट में माइक्रोपिपेट के साथ धीरे से फिर से निलंबित किया गया।
4.10. 20 mM EDTA की 1 mL डालकर तथा माइक्रोपिपेट से धीरे-धीरे मिलाकर अभिक्रिया को समाप्त किया गया।
4.11. 300g पर 10 मिनट तक सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला पदार्थ त्याग दिया गया और अवक्षेप को 5 mg/mL BSA युक्त PBS में तैयार 1 mL 0.1% ट्राइटन X-100 घोल में फिर से निलंबित कर दिया गया। घोल को एक बार दोहराया गया और कुल मिलाकर दो बार धोया गया।
4.12. सतह पर तैरने वाले तरल को 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेन्द्रण द्वारा हटा दिया गया, तथा कोशिकाओं को PBS के साथ नवनिर्मित 5μg/mLPI घोल के 0.5 mL में पुनः निलंबित कर दिया गया, जिसमें 250 μg DNase-मुक्त RNase A था।
4.13. कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक अंधेरे में रखा गया।
4.14. कोशिकाओं का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया, और 520±20 एनएम पर हरा प्रतिदीप्ति देखा गया। PI का लाल प्रतिदीप्ति > 620 एनएम पर देखा गया। PI एपोप्टोटिक और गैर-एपोप्टोटिक दोनों कोशिकाओं को लाल रंग में रंग सकता है, और केवल एपोप्टोटिक नाभिक में ही एलेक्सा फ्लुओर 488-12-DUTP को शामिल किया गया और हरे प्रतिदीप्ति को स्थानीयकृत किया गया।
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