एनेक्सिन वी-ईजीएफपी/पीआई सेल एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट प्रारंभिक सेल एपोप्टोसिस की घटना का पता लगाने के लिए जांच के रूप में ईजीएफपी-लेबल वाले एनेक्सिन वी का उपयोग करता है।
पता लगाने का सिद्धांत इस प्रकार है: सामान्य जीवित कोशिकाओं में, फॉस्फोटाइडिलसेरिन (PS) कोशिका झिल्ली के अंदरूनी भाग पर स्थित होता है, लेकिन शुरुआती एपोप्टोटिक कोशिकाओं में, PS कोशिका झिल्ली के अंदरूनी भाग से कोशिका झिल्ली की सतह पर आ जाता है और बाह्यकोशिकीय वातावरण के संपर्क में आ जाता है। एनेक्सिन-V एक Ca है²⁺ -निर्भर फॉस्फोलिपिड-बाइंडिंग प्रोटीन जिसका आणविक भार 35 से 36 kDa है जो PS से उच्च आत्मीयता के साथ जुड़ता है। फॉस्फेटिडिल सेरीन कोशिका के बाहर उजागर फॉस्फेटिडिल सेरीन के माध्यम से प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं की झिल्ली से बंध सकता है।
इसके अलावा, प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) जीवित प्रारंभिक कोशिकाओं को नेक्रोटिक या देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं से अलग करने के लिए प्रदान किया जाता है। PI एक न्यूक्लिक एसिड डाई है, जो सामान्य कोशिकाओं या प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं की बरकरार कोशिका झिल्ली से होकर नहीं गुजर सकती है, लेकिन देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली से होकर गुजर सकती है और नाभिक को लाल बना सकती है। इस प्रकार, जब एनेक्सिन वी को PI के साथ मिलाया गया, तो PI को जीवित कोशिकाओं से बाहर रखा गया (एनेक्सिन वी^-/पीआई^-) और प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं (एनेक्सिन वी⁺/पीआई^-) देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाएं ईजीएफपी और पीआई (एनेक्सिन वी) दोनों के लिए डबल पॉजिटिव थीं⁺/पीआई⁺).
यह किट फ्लो साइटोमेट्री और फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त है।

उत्पाद घटक

शिपिंग और भंडारण

घटकों को बर्फ के पैक के साथ भेजा जाता है और इन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, प्रकाश से दूर रखें, तथा 1 वर्ष तक बार-बार जमने और पिघलने से बचाएं।
[नोट्स]: यदि इसे कम अवधि में बार-बार उपयोग करने की आवश्यकता है, तो इसे 4 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है और आधे साल तक प्रकाश से बचाया जा सकता है।

चेतावनी

1) चूंकि एपोप्टोसिस एक तीव्र प्रक्रिया है, इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि नमूनों का विश्लेषण अभिरंजन के बाद 1 घंटे के भीतर किया जाए।
2) आसंजक कोशिकाओं के लिए, पाचन एक महत्वपूर्ण चरण है। पाचन समाधान में EDTA का उपयोग न करें क्योंकि EDTA एनेक्सिन V के PS से बंधन को प्रभावित कर सकता है।
3) एनेक्सिन वी-एफआईटीसी, लेकिन एनेक्सिन वी-ईजीएफपी का उपयोग कोशिकाओं को ठीक करने के लिए नहीं किया जाना चाहिए, जैसे कि एक ही समय में एपोप्टोसिस और सेल चक्र का पता लगाना, क्योंकि ईजीएफपी विकृत हो जाएगा और फिक्सेशन के दौरान फ्लोरोसेंस को उत्तेजित करने की अपनी क्षमता खो देगा। फिक्सेशन से पहले कोशिकाओं को एनेक्सिन वी-एफआईटीसी के साथ इनक्यूबेट किया गया और अनबाउंड एनेक्सिन वी-एफआईटीसी को बाइंडिंग बफर से धोया गया।क्योंकि फिक्सेशन के दौरान बढ़ी हुई कोशिका पारगम्यता के कारण कोशिका मलबा उत्पन्न होता है जो एनेक्सिन V से बंध सकता है और परिणामों में बाधा उत्पन्न कर सकता है।
4) अगर सैंपल खून से लिया गया है, तो खून से प्लेटलेट्स निकालना न भूलें। क्योंकि प्लेटलेट्स में PS होता है, जो एनेक्सिन V से जुड़ सकता है, जिससे नतीजों में बाधा आ सकती है। EDTA युक्त बफरिंग एजेंट का उपयोग करके और 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करके प्लेटलेट्स को धोया जा सकता है।
5) कृपया कवर खोलने से पहले अभिकर्मक को थोड़ी देर के लिए अपकेंद्रित्र करें, और कवर खोलते समय तरल छींटे से बचने के लिए कवर की भीतरी दीवार पर तरल को ट्यूब के नीचे फेंक दें।
6) एनेक्सिन वी-ईजीएफपी और पीआई प्रकाश संवेदनशील पदार्थ हैं, इसलिए कृपया ऑपरेशन के दौरान प्रकाश से बचें।
7) केवल अनुसंधान हेतु उपयोग हेतु!

निर्देश

प्रयोग डिजाइन
खाली ट्यूब: वोल्टेज विनियमन के लिए एनेक्सिन वी-ईजीएफपी और पीआई स्टेनिंग सॉल्यूशन रहित नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग किया गया।
एकल अभिरंजित ट्यूब: सकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं, केवल एनेक्सिन वी-ईजीएफपी के साथ पूरक, का उपयोग क्षतिपूर्ति को नियंत्रित करने के लिए किया गया था।
डिटेक्टिंग ट्यूब: कोशिकाओं को एनेक्सिन वी-ईजीएफपी और पीआई स्टेनिंग सॉल्यूशन से उपचारित किया गया। प्रयोगात्मक डेटा खाली ट्यूब और एकल डाई ट्यूब के मापदंडों को समायोजित करके प्राप्त किया गया था।
1.1 नमूना रंगाई
1) निलंबन सेल: कोशिकाओं को 4°C पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया।
अनुयाई कोशिका: EDTA के बिना ट्रिप्सिन के साथ पाचन के बाद, कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया। झूठी सकारात्मकता को रोकने के लिए ट्रिप्सिन पाचन का समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए।
2) कोशिकाओं को दो बार प्री-शील्ड पीबीएस से धोया गया, प्रत्येक बार 300 ग्राम पर, और 5 मिनट के लिए 4 ℃ पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।
3) कोशिकाओं को 1 × बाइंडिंग बफर के साथ पुन: निलंबित किया गया और सांद्रता को 1 ~ 5 × 106 / एमएल तक समायोजित किया गया।
4) 100 μL सेल सस्पेंशन को 5 mL फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में डाला गया, 5 μl एनेक्सिन V-EGFP मिलाया गया, और कोशिकाओं को मिश्रित किया गया और प्रकाश के तहत कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया।
5) 10 μl PI समाधान और 400 μl PBS मिलाकर, तुरंत धुंधलापन किया गया।
[नोट्स]: एपोप्टोसिस का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करते समय, पीआई समय से बहुत प्रभावित होता है, और बहुत लंबा समय पीआई धुंधलापन में वृद्धि करेगा, इसलिए फ्लो साइटोमेट्री 1 घंटे के भीतर पूरी की जानी चाहिए।
1.2 फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
EGFP की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 488 एनएम थी, और अधिकतम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 507 एनएम थी; PI-DNA कॉम्प्लेक्स की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य 535 एनएम थी, और अधिकतम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 615 एनएम थी। विश्लेषण के लिए सेलक्वेस्ट जैसे सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया गया और दो-रंग डॉट प्लॉट तैयार किया गया, EGFP एब्सिस्सा है और PI ऑर्डिनेट है। प्रति नमूने 10,000 घटनाएँ एकत्र करें। एक विशिष्ट प्रयोग में, कोशिकाओं को तीन उपसमूहों में विभाजित किया जा सकता है, जीवित कोशिकाओं में केवल बहुत कम तीव्रता वाली पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति होती है, प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं में केवल मजबूत हरा प्रतिदीप्ति होती है, और देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं में हरा और लाल प्रतिदीप्ति डबल धुंधलापन होता है।