विवरण
एनेक्सिन वी-एलेक्सा फ्लुओर488/पीआई एपोप्टोसिस डिटेक्शन किट का पता लगाने का सिद्धांत इस प्रकार है: सामान्य जीवित कोशिकाओं में, फॉस्फोटाइडिलसेरिन (पीएस) कोशिका झिल्ली के अंदरूनी हिस्से में स्थित होता है, लेकिन शुरुआती एपोप्टोटिक कोशिकाओं में, पीएस कोशिका झिल्ली के अंदरूनी हिस्से से कोशिका झिल्ली की सतह पर आ जाता है और बाह्यकोशिकीय वातावरण के संपर्क में आ जाता है। एनेक्सिन-वी एक कैल्शियम है2+ -निर्भर फॉस्फोलिपिड-बाइंडिंग प्रोटीन जिसका अणुभार 35 से 36KD होता है, जो PS से उच्च बंधुता के साथ बंधता है और कोशिका के बाहर प्रकट होने वाले फॉस्फेटिडिलसेरिन के माध्यम से प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली से बंधता है।
इसके अलावा, प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) जीवित प्रारंभिक कोशिकाओं को नेक्रोटिक या देर से एपोप्टोटिक कोशिकाओं से अलग करने के लिए प्रदान किया जाता है। PI एक न्यूक्लिक एसिड डाई है, जो सामान्य कोशिकाओं या प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं की बरकरार कोशिका झिल्ली से होकर नहीं गुजर सकती है, लेकिन देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली से होकर गुजर सकती है और नाभिक को लाल बना सकती है। इस प्रकार, जब एनेक्सिन वी को PI के साथ मिलाया गया, तो PI को जीवित कोशिकाओं से बाहर रखा गया (एनेक्सिन वी-/पीआई-) और प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाएं (एनेक्सिन वी+/पीआई-) इसके विपरीत, देर से एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाएं एलेक्सा फ्लुओर488 और पीआई (एनेक्सिन वी) के लिए डबल पॉजिटिव थीं+/पीआई+).
उत्पाद घटक
| अवयव |
| 40305ES20（20T） | 40305ES50（50T） | 40305ES60（100T） |
| 40305-ए | एनेक्सिन वी-एलेक्सा फ्लोर488 | 100 μएल | 250 μएल | 500 μएल |
| 40305-बी | पीआई धुंधला समाधान (20 μg/एमएल) | 200 μएल | 500 μएल | 1.0 एमएल |
| 40305-सी | 4×बाइंडिंग बफर | 10 एमएल | 25 एमएल | 50 एमएल |
शिपिंग और भंडारण
घटकों को बर्फ के पैक के साथ भेजा जाता है तथा इन्हें -20°C तापमान पर 1 वर्ष तक भंडारित किया जा सकता है।
चेतावनी
1) चूंकि एपोप्टोसिस एक तीव्र प्रक्रिया है, इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि नमूनों का विश्लेषण अभिरंजन के बाद 1 घंटे के भीतर किया जाए।
2) आसंजक कोशिकाओं के लिए, पाचन एक महत्वपूर्ण चरण है। पाचन समाधान में EDTA का उपयोग न करें क्योंकि EDTA एनेक्सिन V के PS से बंधन को प्रभावित कर सकता है।
3) अगर सैंपल खून से लिया गया है, तो खून से प्लेटलेट्स निकालना न भूलें। क्योंकि प्लेटलेट्स में PS होता है, जो एनेक्सिन V से जुड़ सकता है, जिससे नतीजों में बाधा आ सकती है। EDTA युक्त बफरिंग एजेंट का इस्तेमाल किया जा सकता है और 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्लेटलेट्स को धोया जा सकता है।
4) कृपया कवर खोलने से पहले अभिकर्मक को थोड़ी देर के लिए अपकेंद्रित्र करें, और कवर खोलते समय तरल छींटे से बचने के लिए कवर की भीतरी दीवार पर तरल को ट्यूब के नीचे फेंक दें।
5) एनेक्सिन वी-एलेक्सा फ्लुओर488 और पीआई प्रकाश-संवेदनशील पदार्थ हैं और इन्हें संभालते समय प्रकाश से दूर रखना चाहिए।
6) केवल अनुसंधान हेतु उपयोग हेतु!
निर्देश
1.1 नमूना रंगाई
1.ए) निलंबन सेल: कोशिकाओं को 4°C पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्र किया गया।
बी) आसंजक कोशिका: EDTA के बिना ट्रिप्सिन के साथ पाचन के बाद, कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया। झूठी सकारात्मकता को रोकने के लिए ट्रिप्सिन पाचन समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए।
2. कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्वशीतित पीबीएस से दो बार धोया गया, प्रत्येक बार 300 ग्राम का उपयोग करके, और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज किया गया।
3. कोशिकाओं को 250 μL 1 × बाइंडिंग बफर जोड़कर पुन: निलंबित किया गया, और सांद्रता को 1 × 106 / एमएल तक समायोजित किया गया।
4. 100 μL सेल सस्पेंशन को 5mL फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में डाला गया, 5μL एनेक्सिन V-एलेक्सा फ्लुओर 488 और 10 μL PI मिलाया गया, और धीरे से मिलाया गया।
5. प्रतिक्रिया को प्रकाश से दूर रखा गया और 15 मिनट तक कमरे के तापमान पर रखा गया।
6. 1×बाइंडिंग बफर के 400 μL को मिलाया गया, मिश्रित किया गया, और नमूनों को 1 घंटे के भीतर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया गया।
[नोट्स]: सेल धुलाई के दौरान सेल की हानि से बचने के लिए, तरल पदार्थ को चूसने के लिए एक छोटी सी टिप का उपयोग किया जा सकता है।
1.2 फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
एलेक्सा फ्लुओर488 की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्घ्य 488 एनएम और अधिकतम उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य 519 एनएम है; पीआई-डीएनए कॉम्प्लेक्स की अधिकतम उत्तेजना तरंगदैर्घ्य 535 एनएम थी, और अधिकतम उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य 615 एनएम थी। सेलक्वेस्ट और अन्य सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एलेक्सा फ्लुओर488 को एब्सिस्सा और पीआई को ऑर्डिनेट के रूप में लेकर दो-रंग डॉट प्लॉट का विश्लेषण और आरेखण किया गया। प्रति सैंपल 10,000 इवेंट एकत्रित करें।
1.3 प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी विश्लेषण
1) एनेक्सिन वी-एफआईटीसी/पीआई से डबल-रंजित सेल सस्पेंशन की एक बूंद स्लाइड पर डालें और कोशिकाओं को कवर स्लिप से ढक दें।
2) इसे दो-रंग फिल्टर वाले फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया। एनेक्सिन वी-एफआईटीसी फ्लोरोसेंस सिग्नल हरा था, और पीआई फ्लोरोसेंस सिग्नल लाल था।
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